Detección de antígenos empleando fragmentos VHH de Llama estables en condiciones desnaturalizantes

DOÑA VV; URRUTIA M; BAYARDO M; GOLDBAUM F; CHIRDO FG

Mar del Plata

Congreso; LI Reunión Annual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2006

Sociedad Argentina de Inmunología

El empleo de agentes reductores y desnaturalizantes en la extracción de analitos de muestras con matrices complejas parece ser una alternativa adecuada para aquellas situaciones, como la certificación de alimentos para consumo por enfermos celíacos, donde se requiere la máxima recuperación del analito. Sin embargo, aún bajas cantidades residuales de dichos agentes interfieren con la determinación cuantitativa cuando se usan inmunoensayos. Conociendo que los camélidos producen un tipo de anticuerpos de una sola cadena, donde la unión al antígeno ocurre por un dominio (VHH) muy compacto y estable, en trabajos previos se produjo una biblioteca de display en fagos de fragmentos VHH de Llama específicos de gliadinas. De la biblioteca, se seleccionaron los fagos que conservasen la capacidad de reconocimiento de antígeno en condiciones desnaturalizantes: presencia de etanol, cloruro de guanidinio (G) y 2-mercaptoetanol (2ME). Los seis clones seleccionados en primer lugar presentaron una secuencia aún no descripta para VHHs con un puente disulfuro en el CDR3, cuatro tuvieron la misma secuencia (clones 11, 19, 33 y 36), uno difirió en un residuo (clon 13) y el clon 26, el más estable, tiene 10 residuos diferentes. El clon 26, tuvo capacidad de reconocer al antígeno nativo aún en presencia de etanol 15%, 0.5% 2ME, 0,5M G. Además, fue posible desarrollar un ensayo cuantitativo con un nivel de detección de 5 ng de gliadinas/ml. En una segunda estrategia, empleando antígeno desnaturalizado, se seleccionó un solo clon (230) que reconoce tanto el antígeno nativo como al desnaturalizado, y mantuvo su capacidad de reconocimiento aún en presencia de etanol 15%, 0,5% 2ME, 0,5M G. En conclusión, se obtuvieron fagos con fragmentos VHH capaces de reconocer solo el antígeno nativo o tanto al nativo como desnaturalizado. Los clones seleccionados son resistentes a etanol, 2ME y G, y permiten el desarrollo de ensayos de cuantificación con niveles adecuados de detección.