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La detección específica de proteínas presentes en productos alimenticios y farmacéuticos requiere, en ciertos casos, el empleo de técnicas de elevada capacidad de detección con el objeto de evitar la inducción de reacciones adversas o tóxicas. En particular, los pacientes celíacos, quienes poseen una intolerancia permanente a un grupo de proteínas de trigo (referidas como gliadinas o gluten), requieren el seguimiento estricto de una dieta de exclusión de dichas proteínas. Aunque nuestro grupo ha desarrollado varios ensayos inmunoquímicos para la certificación de productos libres de gluten con características equivalentes a las del ensayo comercial Tipo I del Codex Alimentarius Comission (límite de detección 1 ng gliadinas/ml), es deseable incrementar la capacidad de detección. La técnica de inmuno-PCR combina la versatilidad del ELISA con el poder de amplificación de la PCR, mediante el acoplamiento del anticuerpo de detección a un oligonucleótido que luego sirve de molde en una reacción de PCR. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de una técnica combinada de inmuno-PCR para la detección de gliadinas. Se emplearon anticuerpos monoclonales (mAb) anti-gliadinas de nuestro panel en la optimización de un ELISA de captura para la etapa inmunoquímica de la inmuno-PCR. Para la segunda etapa, amplificación por PCR, se empleó un puente de avidina entre el mAb secundario y un oligonucleótido ambos biotinilados. La lectura se realizó en un equipo de Real-Time PCR, y los resultados fueron graficados como Ct vs concentración de gliadinas. Dado que es una técnica de muy alta sensibilidad (siendo el principal inconveniente altos valores en los blancos), se debieron analizar cada una de las etapas con el fin de elegir las condiciones que permitieran obtener la mayor diferencia de señal entre muestras positivas y blancos. Luego de optimizar todas las variables involucradas, se obtuvo una curva de calibración estándar con un límite de detección de 5 pg gliadinas/ml. Este ensayo mostró una capacidad de detección 50 veces superior a la del ELISA de captura que emplea los mismos mAbs y 200 veces superior a la del ensayo comercial. En conclusión, se optimizó un ensayo para la cuantificación de gliadinas mediante Real-Time Inmuno-PCR que presenta una capacidad de detección muy superior a la de los ensayos en uso. Esta es una plataforma analítica que permite la detección específica de muy bajos niveles de proteínas.

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