Purificación de Transportadores de Azúcares Nucleótidos expresados en Pichia pastoris

BREDESTON LM; HIRSCHBERG CARLOS B.

La Plata

Congreso; XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

Los Transportadores de Nucleótidos Azúcares (NST) transportan  nucleótidos azúcares desde el citosol hacia el lumen del Retículo Endoplásmico y el Aparato de Golgi de las células eucariotas donde son utilizados  en la síntesis de diversos glicoconjugados. Los NST son proteínas hidrofóbicas de alrededor de 30-40 kDa con 6-10 segmentos transmembránicos cuya expresión y purificación en cantidades adecuadas constituye el principal limitante para los estudios de estructura –función. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en la expresión de NST en Pichia pastoris. La secuencia de 11 NST de diversos orígenes (Slc35d3 y GDP-Fucosa de Homo sapiens; SRF-3, SQV-7, CO3H5.2, F44C8.7, ZK896.9 de  C.elegans; CMP-acido sialico de Mus musculus, UDP-galactosa de E. histolytica, HUT1 de S. pombe,  GNST de Giardia lambia) fueron clonados en el vector pPICZb con la secuencia VSV-His6 en el extremo c-terminal  para transformar células X-33 de Pichia pastoris. Las colonias resistentes a zeocina que integraron el vector fueron identificadas por PCR y crecidas  en medio con glicerol por 24 hs. Luego que el cultivo alcanzara una  DO600 =1 se indujo con  metanol 0.5 %. Los niveles de expresión de los diferentes NST se analizaron por western blot utilizando el anticuerpo anti VSV. Los tiempos necesarios para la inducción de los NST fueron desde 6 hs en el caso de HUT1 y entre 48-60hs para el resto de los NST. Los tiempos óptimos para alcanzar el máximo nivel fueron entre 2 y 4 dias. Slc35d3 y GNST no se expresaron.   La solubilización de HUT1 a partir de membranas aisladas fue ensayada con los detergentes Triton X-100, C12E10, DOC, y DDM. En todos los casos se obtuvo similar extracción. Para la purificación de HUT1 se cosecharon 18g de 1 litro de cultivo (DO600=15-17)  luego de inducir con metanol 1% durante 48hs. Las células se rompieron por acción mecánica y se obtuvieron membranas por centrifugación a 100.000xg. Se solubilizó con C12E10 1% y se purificó con una columna de NTA-Ni. El rendimiento final de proteína pura analizada por coomassie-blue fue de aproximadamente 0.5 mg. Estos resultados permiten abordar el crecimiento en fermentador con el objetivo de  obtener mayores rendimientos en biomasa.