IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Efectos del Na+ y del ATP sobre la constante de velocidad de desoclusión de Rb+ de la Na+/K+-ATPasa
Autor/es:
MONTI, J. L. E.; SPIAGGI, A. J.; SCHVARTZ, P. G.; ROSSI, R. C.; GARRAHAN, P. J.
Lugar:
Bernal, Buenos Aires, Argentina
Reunión:
Taller; Biofísica de macromoléculas: aspectos estructurales e implicancias biológicas y biotecnológicas; 2007
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Biofísica
Resumen:
El mecanismo
catalítico del transporte de Na+ y K+ por la Na+/K+-ATPasa
no se conoce detalladamente. Existen intermediarios de reacción en los que el K+
se halla ocluido (atrapado en la enzima). A concentraciones saturantes de Na+
y K+, el paso limitante del ciclo es la desoclusión del K+,
siendo el ATP capaz de acelerar esta reacción unas 200 veces. En el presente
trabajo demostramos que dicho efecto es modulado por la concentración de Na+.
Se emplearon
fragmentos de membrana conteniendo Na+/K+-ATPasa
purificada a partir de la médula externa del riñón de cerdo según se describe
en [1]. El intermediario ocluído con Rb+ (un análogo del K+)
se obtuvo incubando la enzima a 25ºC
en un medio conteniendo [86Rb+]RbCl, imidazol-HCl 25mM, EDTA 0.25mM,
pH=7.4 hasta alcanzar el equilibrio. Luego se incubó distintos tiempos a 25ºC en medios conteniendo
0.01 o 2.5mM ATP, 0.5mM de Mg2+ libre, imidazol-HCl 25mM, pH=7.4, y
diferentes concentraciones de NaCl (0-170mM) empleando ColinaCl (una sal
inerte) para mantener constante la fuerza iónica del medio de reacción. Al cabo
de dicha incubación se cuantificó el Rb+ ocluído en la enzima tal
como se describe en [2].
A 10μM ATP, la
velocidad inicial de desoclusión disminuye con el incremento de [Na+].
El ajuste de una hipérbola brinda un valor aproximado de K0.5 de 104±37mM.
A 2500μM ATP, en
cambio, la velocidad de desoclusión aumenta hiperbólicamente a medida que la
concentración de Na+ aumenta de 0 a 100mM con una K0.5 de 18±4mM, pero a
concentraciones aún mayores la velocidad comienza a disminuir.
Si bien el
efecto activador del Na+ a alta [ATP] es conocido (ver [3]), hasta
ahora no se había detectado la inhibición a mayores concentraciones del catión,
lo cual indicaría la presencia de al menos 2 sitios de unión para el Na+
en E2(Rb2)ATP.