Informe Final de Beca Interna de Formación de Postgrado Cofinanciada CONICET/PORFENC SRL

TORRES M.J.

2009-12-01/2011-06-01

Biológica

Sanidad ambiental

El objetivo general en este trabajo de investigación fue desarrollar y evaluar nuevas metodologías biológicas que colaboren naturalmente con el control de insectos perjudiciales para la salud humana como la mosca doméstica. Para tal fin, se propuso estudiar el diseño de un suplemento con bacterias como Bacillus y bacterias lácticas, solos o en combinación con los productos de su metabolismo. Esto constituiría una alternativa para el control natural de insectos, patógenos o vectores potenciales de enfermedad. Además, para cada sustancia o microorganismo a administrar, se propone analizar cuál es la mejor vía de administración que asegure una acción efectiva. Este trabajo de investigación correspondió a una parte del plan con el que obtuve mi título de Doctora en Ciencias, Área Química Aplicada con el tema: ?Estudio y caracterización de compuestos de origen bacteriano para el biocontrol de patógenos? (Fac. de Cs. Exactas, Universidad Nacional de Salta. 18/03/2014)Objetivos Específicos-Estudiar las propiedades larvicidas o pupicidas de cepas del género Bacillus y/o de bacterias lácticas preseleccionadas en el grupo de trabajo. Analizar nuevos microorganismos aislados de animales o nichos ecológicos de interés económico para la República Argentina.-Estudiar, a través de bioensayos a escala laboratorio, los efectos antagónicos de las células bacterianas y/o sus metabolitos sobre la mosca doméstica, Musca domestica L. (Diptera: Muscidae).-Diseñar un medio de cultivo adecuado para la producción a gran escala y económicamente rentable de las bacterias seleccionadas como agentes potenciales de biocontrol para obtener tanto células como metabolitos-Formular un suplemento con los microorganismos y/o sus metabolitos elegidos para realizar ensayos exploratorios de biocontrol a campo. A continuación se describen las tareas realizadas y se informan los resultados más relevantes que se han obtenido:-Aislamiento de cepas del género Bacillus de camas de aves. Se llevaron a cabo aislamientos de muestras de camas de aves procedentes de diferentes granjas de gallinas ponedoras de la localidad de San Luis, provincia de Salta. Las diferentes muestras fueron sembradas en superficie en los siguientes medios de cultivo: infusión-cerebro-corazón (BHI), Muller Hinton, MRS y MPYGP. Las placas se incubaron a 37ºC tanto en aerobiosis como en condiciones de microaerofilia hasta que se detectó crecimiento (ca. 24-48h). Se procedió al aislamiento en caldo BHI de aquellas colonias típicas del género Bacillus. 18 cepas fueron aisladas y conservadas a -20ºC en caldo BHI con el agregado de glicerol al 20% v/v. -Obtención de una cohorte de Musca domestica L. en laboratorio. Se estableció una colonia de 2000 a 2500 moscas, a partir de Musca domestica L. capturadas en una granja de gallinas ponedoras (localidad de San Luis, Salta, Argentina). Las moscas, tanto las capturadas como las que nacieron en condiciones de laboratorio se mantuvieron a 26±1 ºC y 57±3 % de temperatura y humedad relativa, respectivamente, con un fotoperiodo de L14:O10.-Evaluación de diferentes dietas sobre el ciclo de Musca domestica L. A fin de seleccionar una dieta artificial, básica, confiable y económica para el desarrollo de larvas se comparó la dieta DA (gramos de: Levadura de panadería (11,11), Salvado de trigo (444,44), Extracto de malta (18,52), Alfalfa (222,22) y agua (1000), Ashby, 1972) con 2 dietas artificiales más: DL (gramos de: Salvado de trigo (34,0), leche entera en polvo (1,0) y agua (64,9), Ruiu y col, 2005) y DM (salvado de trigo, leche entera en polvo, melaza y sales). La alimentación de adultos fue Ad libitum con solución azucarada al 30%. Se determinó: duración total del ciclo, longevidad de larvas y pupas, tiempo de sobrevida de adultos, % de pupación, % de emergencia de adultos, longitud/diámetro/peso al 4° día de pupas, longitud de adultos. Los ensayos se realizaron por cuadriplicado.- Se determinó que las 3 dietas generaron un ciclo de 33 días y la longevidad de larvas y pupas fue de 6 y 7 días, respectivamente. Los máximos % de pupación se observaron al 12° día (80%, 60% y 46% para DL, DA y DM, respectivamente). La longitud, diámetro y peso de pupas de 4 días fue similar para DM y DA pero menores con DL. El % máximo de emergencia de adultos fue 45%, 18% y 42%, para DL, DA y DM, respectivamente, entre el 15° y 17° día. La longevidad de los adultos fue similar entre las dietas e igual a 19 días; pero, se midieron diferencias en el tiempo de sobrevida del 75% de los adultos (15 días para DM y 26 días para las otras dietas). La cinética de muerte fue similar para las 3 dietas. Sí se observaron diferencias significativas en la longitud de hembras con DM y DL pero no tuvieron efecto en el tamaño de los machos. Se eligió el medio DL por su bajo costo y fácil uso en el laboratorio para ensayos posteriores.-Microscopía electrónica de barrido (SEM). Se estudió, en larvas de tercer estadio y adultos de Musca domestica L. desarrolladas en la dieta DL, su estructura externa por medio de técnicas de microscopía utilizando SEM. Los individuos de cada estadio, fueron lavados con solución fisiológica 2 o 3 veces y luego fijados con glutaraldehído al 2,5% bufferado, durante 48 hs a 4°C. Luego se realizó la deshidratación al 10%, 30%, 50%, 70% y 96%, dejando en contacto la muestra 1 hora con cada solución alcohólica. Finalmente, se produjo el secado y metalizado de la muestra para su posterior estudio por SEM (Microscopio Electrónico de Barrido, marca JEOL Modelo JSM 6480 LV). Con dicha técnica se logró identificar las características taxonómicas propias de la especie.-Estudio de temperatura y humedad medias en los meses de verano y efecto sobre el desarrollo de Musca domestica L. A fin de encontrar las medias de temperatura y humedad en laboratorio en los meses de enero (E), febrero (F) y marzo (M) del año 2010, en Salta-Argentina (24°43? S y 65°24? O) y evaluar la influencia de tales parámetros sobre el desarrollo de la Musca domestica L., se registraron la temperatura y la humedad cada 2 horas, diariamente, con lo que se calculó la media mensual de cada mes. El estudio se realizó en condiciones semi-controladas, por lo que se utilizó la dieta DL, previamente seleccionada en este trabajo. Se estudió el ciclo del insecto desde huevo hasta la muerte del último adulto para cada mes. Los parámetros evaluados fueron: % de supervivencia de pupas y adultos, longevidad de adultos en cada mes. Los resultados obtenidos pusieron en evidencia que del 100% de huevos evaluados en cada mes la mayor supervivencia de los individuos en los estados de pupa y adultos de Musca domestica L. fue en el mes de M (Pupas 93%: Adultos 92%), con una temperatura media mensual de 27°C y una humedad media mensual de 68%; mientras que los meses de E y F presentaron medias de temperatura y humedad de 27°C ? 57% y 28°C ? 68%, respectivamente. En los meses de E y F la supervivencia fue de Pupas 88%: Adultos 64% y Pupas 73%: Adultos 62%, respectivamente.-Eficacia del acido benzoico y benzoato de sodio sobre individuos de diferentes estados de Musca domestica L. Se realizaron una serie de experimentos independientes. 1) Ciclo completo de Musca domestica (Desde eclosión de huevos hasta emergencia de adultos): Se colectaron 10 huevos y se colocaron en cajas de Petri con sustrato (salvado de trigo, leche entera en polvo), se humedeció con agua como control (DA) y con soluciones de 0,025%, 0,05% y 0,1% de acido benzoico (DAB 0,1%, DAB 0,05%, DAB 0,025%) y benzoato de sodio (DBNa 0,1%, DBNa 0,05%, DBNa 0,025%), con cuatro repeticiones por tratamiento. Se realizó el seguimiento hasta la muerte de los adultos. Los parámetros a evaluar fueron: % de mortalidad hasta el estado de pupas y hasta emergencia de adultos, % supervivencia y longevidad de larvas y pupas, longevidad y sobrevida de adultos evaluada con el análisis de Kaplan-Meier (α=0,05). 2) Estado Adulto: Se estudiaron los efectos del ácido orgánico (TAB 0,1%, TAB 0,05%, TAB 0,025%) y su sal (TBNa 0,1%, TBNa 0,05%, TBNa 0,025%) sobre la longevidad y sobrevida de adultos de Musca domestica L. (Kaplan ? Meier). El ensayo se realizó con 10 moscas de igual edad por cuadruplicado para cada tratamiento. Desde el primer día de emergencia hasta el octavo día, se administró directamente a los adultos una dilución 1:1 de las diferentes soluciones (arriba mencionadas) y una solución azucarada al 60%. Desde el noveno día hasta la muerte del último adulto se alimentó con una solución azucarada al 30%. Para la evaluación de la longevidad y sobrevida de los adultos se registró el número de individuos muertos por día desde el primer día de administración de las soluciones hasta la muerte de los adultos. El análisis de los datos mostró que el efecto de las diferentes soluciones de ácido orgánico y su sal no es significativo (p=0,35 y 0,37) sobre la longevidad ni sobre la supervivencia de larvas y pupas, mientras que cuando se siguió durante el ciclo el efecto hasta la emergencia de los adultos, se observó una proximidad a la significancia de 0,05 con un p=0,0800. Estos resultados estarían indicando un efecto insecticida que podría ser potenciado aumentando el número de aplicaciones ya que antecedentes denotan una toxicidad baja de estos compuestos en medios terrestres (CONCISE INTERNATIONAL CHEMICAL ASSESSMENT DOCUMENT NO. 26). También, se podría plantear sinergismos con microorganismos entomopatógenos, siempre que su viabilidad no se vea afectada con la acción de estos compuestos. Mientras que, con adultos alimentados directamente con dichas soluciones de ácido benzoico y su sal, se observó un potencial efecto entomopatógeno del ácido benzoico 0,1%, causando la muerte del 50 % de los adultos al 6° día a diferencia del control, con el cual recién a los 14 días se observó tal efecto. TBNa 0,1% evidenció un efecto significativo sobre los adultos tratados (p=0,000807) pero la sobrevida del 50% de los mismos fue igual al control (14 días).-Evaluación del efecto de sulfito ácido de sodio y bisulfato ácido de sodio sobre Musca domestica L. Se colectaron 10 larvas neonatas y se colocaron en cajas de Petri con sustrato (salvado de trigo, WPC 35), se humedeció con agua como control (DA) y con soluciones de 0,025%, 0,05% y 0,1% de sulfito ácido de sodio (DACP 0,1%, DACP 0,05%, DACP 0,025%) y bisulfato ácido de sodio (DMBS 0,1%, DMBS 0,05%, DMBS 0,025%), con cuatro repeticiones por tratamiento. Se realizó el seguimiento hasta la muerte de los adultos. Los parámetros a evaluar fueron: % de pupación, % de emergencia de adultos y Prueba de Fridman al D10P y D19P, para encontrar diferencias significativas entre tratamientos (α=0,05). Además, se estudiaron los efectos de sulfito ácido de sodio (TACP 0,1%, TACP 0,05%, TACP 0,025%) y bisulfato ácido de sodio (TMBS 0,1%, TMBS 0,05%, TMBS 0,025%) comparados al control (TA) en el estado de adultos. El ensayo se realizó con 10 moscas de igual edad por cuadruplicado para cada tratamiento. Desde el primer día de emergencia hasta el séptimo día, se administró directamente a los adultos una dilución 1:1 de las diferentes soluciones (arriba mencionadas) y una solución azucarada al 30%. Desde el octavo día hasta la muerte del último adulto se alimentó con una solución azucarada al 30%. Para la evaluación de la longevidad y sobrevida de los adultos se registró el número de individuos muertos por día desde el primer día de administración. Se determinó la dosis letal 50 y 97.5 (DL50, DL97.5) para el 7° día a partir de su administración. A través de un análisis de Fridman de los datos obtenidos con el ciclo de Musca domestica L., se pudo determinar un efecto significativo de reducción de individuos en sus diferentes etapas que tuvieron ACP 0,1%, ACP 0,05% y MBS 0,05% con respecto al control. Se determinó que los individuos tratados con ACP 0,01% y ACP 0,05% presentaron un efecto significativo sobre la sobrevida de los adultos. La dosis letal determinada de ACP DL97.5 fue de 0,373 g/mL, mientras que la DL 50 fue de 0,164 g/mL.-Efecto del sobrenadante libre de células de Lb. johnsonii CRL1647 sobre Musca domestica L. Se evaluó el efecto de CRL 1647 sobre el ciclo de Musca domestica L., fecundidad de hembras - fertilidad de machos y sobre adultos directamente alimentados con el sobrenadante libre de células (SLC). Para el ciclo, se colocaron larvas neonatas en medios DL humedecidos con agua (control 1), medio de cultivo MRS (control 2) y con SLC 1647, y por otro lado, los adultos fueron alimentados con solución azucarada al 30% (control) y con diluciones 1:1 de SLC 1647 y solución azucarada al 60%. Todos los ensayos se desarrollaron con ocho repeticiones por tratamiento. Los parámetros a evaluar en el ciclo fueron: % de pupación, % de emergencia de adultos y longevidad de pupas y adultos. Se determinó la Sobrevida de Kaplan-Meier de los adultos alimentados con el SLC de CRL 1647.-Los resultados mostraron un efecto larvicida y pupicida del SLC de CRL 1647 sobre el ciclo de la Musca domestica L. como también sobre la longevidad de los individuos en cada estado. También se puso en evidencia que hembras y machos provenientes de larvas alimentadas con SLC de CRL 1647 redujeron su fecundidad en un 57% y su fertilidad en un 15%, respectivamente, mientras que con una combinación de ambos la reducción de la fecundidad fue de 56%. No se observó disminución significativa en la sobrevida de adultos alimentados con SLC de CRL 1647 con respecto al control.-Caracterización química de/los metabolito/s activos en el SLC de CRL 1647. Se procedió a la neutralización (hasta un valor de pH cercano a 7) y calentamiento (10 minutos, Temperatura de ebullición) de los SCL de CRL 1647. Se colocaron larvas neonatas sobre medios DL humedecidos con agua (control 1), SLC de CRL 1647 (control 2), medio MRS (control 3), SLC neutralizados (SLCN) y SLC calentados (SLCC). Los parámetros a evaluar en el ciclo fueron: % de pupación, % de emergencia de adultos y longevidad de pupas y adultos.-Los resultados solo pusieron en evidencia un elevado efecto larvicida y pupicida de SLCC, igual efecto observado con SCL de CRL 1647 sin tratar, lo que demostraría la naturaleza acídica de/los metabolitos activos en el SCL de CRL 1647, ya que al neutralizar se perdió dicho efecto. -Ensayo efecto de cepas de Bacillus spp sobre el ciclo de Musca domestica L. Se evaluó el efecto de 10 cepas de Bacillus (Dragone 3, C3, Cachi 7, LO3, M5d, Mori 7, Juli 1, C4, M1d, 16r) sobre el ciclo de Musca domestica L., y sobre adultos directamente alimentados con los diferentes cultivos de Bacillus (106-107 ufc/mL). Para el ciclo, se colocaron larvas neonatas en medios DL humedecidos con agua (control 1), medio de cultivo (Muller Hinton) y con cultivos de los 10 Bacillus evaluados, y por otro lado, los adultos fueron alimentados con solución azucarada al 30% (control) y con diluciones 1:1 de cada cultivo de Bacillus y solución azucarada al 60%. Todos los ensayos se desarrollaron con cuatro repeticiones por tratamiento. Los parámetros a evaluar en el ciclo fueron: % de pupación, % de emergencia de adultos y longevidad de pupas y adultos. Se determinó la Sobrevida de Kaplan-Meier de los adultos alimentados con los diferentes cultivos de Bacillus. De las 10 cepas de Bacillus evaluadas, solo dos, LO3 y Dragone 3, mostraron un efecto significativo sobre el % pupación y emergencia de adultos; mientras que cuando se alimentó a los adultos con los diferentes cultivos, 8 cepas de Bacillus lograron a los 3 días de administración reducir la sobrevida un 97%. Debido a dichos resultados, se seleccionaron para posteriores estudios LO3 y Dragone 3.-Diseño del medio de cultivo y optimización de los parámetros vinculados con la fermentación de cepas de Bacillus. Actualmente, se está evaluando la viabilidad y capacidad de esporulación de LO3 y Dragone 3 en medio semi-sólido DL a 37°C, al que se le ha modificado las condiciones de suministro de oxígeno: 1) 96 h O2, 2) 96 h microaerofilia, 3) 48 h O2-48 h microaerofilia y se compara con medio líquido, Muller Hinton, con 96 h O2 a 37°C. Los ensayos se realizarán por tres repeticiones, posteriormente serán analizados con el análisis de varianza (ANOVA) con arreglo factorial para determinar interacción entre variables evaluadas.-Análisis estadístico de los datos. Para el análisis de los datos se utilizó un diseño completamente aleatorizado; se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y comparaciones múltiples Tukey, (DMS, p≤0,05). Además se realizó un análisis de la varianza no paramétrico Kruskal-Wallis y se empleó el análisis de sobrevivencia según curvas de Sobrevida (Kaplan-Meier), Sobrevida Logrank Test?Chi Cuadrado, utilizando el paquete estadístico de InfoStat (Di Rienzo y col., 2010).