Aislamiento y caracterización de levaduras para la construcción de un Banco de Levaduras Cerveceras. Estudios de floculación y criotolerancia

VERÓNICA CAROLINA BORROMELI; SOFÍA SAMPAOLESI; SIMÓN MONGI; VICTOR MONOPOLI

Quilmes

Simposio; IV Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2016

Universidad Nacional de Quilmes

Aislamiento y caracterización de levaduras para la construcción de un Banco de Levaduras Cerveceras. Estudios de floculación y criotolerancia.Verónica Carolina Borromelli1, Sofía Sampaolesi1, Simón Mongi1, Víctor Monopoli1, Patricio De Urraza1, Graciela De Antoni1, Ángela León Peláez1.1 Laboratorio de la Cátedra de Microbiología General de la Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, C.P. 1900, La Plata, Argentina.veronicaborromelli@gmail.comResumenEl presente trabajo describe el aislamiento y caracterización morfológica de levaduras cerveceras a partir de muestras comerciales liofilizadas, la evaluación de su capacidad floculante mediante una adaptación del ensayo de Helms y el estudio de su tolerancia a ciclos de congelación-descongelación en presencia de distintos criopreservantes mediante recuento de viables pre y post ciclo. Los resultados indican que los liofilizados de levadura cervecera comerciales están constituidos por más de una cepa de levadura, que se diferencian no sólo en su morfología macroscópica sino también por su capacidad de fermentar melibiosa y sus características floculantes. Una cepa tipo ale seleccionada demostró tolerar sucesivos ciclos de congelamiento/descongelamiento en todas las condiciones ensayadas sin presentar reducción en el recuento de viables.Palabras clave Levadura cervecera; propiedades tecnológicas; floculación; criopreservación; banco de levaduras.Introducción En Argentina, el mercado de la cerveza artesanal representa hoy cerca del 5% del mercado total de la cerveza que se produce en el país. Solo en la ciudad de La Plata existen más de 50 productores de cerveza artesanal que funcionan como pequeños emprendedores, además de los ?homebrewers? o cerveceros caseros. El aumento en el consumo y producción de la cerveza artesanal ha generado una demanda del sector por un mayor grado de tecnificación e interacción con las Universidades y entidades de CyT. En el ámbito local, esta demanda se tradujo en la iniciativa conjunta de un grupo de productores platenses y la Secretaria de Extensión de la FCEx, UNLP, para la creación de un Banco de Levaduras Cerveceras.El proyecto propone el aislamiento de cepas de levaduras a partir de muestras comerciales, muestras cerveceras locales y fondos de fermentación no pasteurizados, su identificación y caracterización tecnológica y el estudio de métodos de preservación para seleccionar el más adecuado en la construcción del Banco de Levaduras.MetodologíaA partir de suspensiones de levaduras cerveceras comerciales liofilizadas (Fermentis, France; Lallemand, Canada) en PBS estéril (0,5g en 50 ml) se realizaron diluciones seriadas para obtener recuentos de entre 5 y 10 colonias por placa de agar YGC (Britania) incubado durante 7 días a 30 °C. Se aislaron las colonias morfológicamente distintivas mediante pasajes en agar YGC hasta observación de morfología homogénea en 3 repiques sucesivos y se verificó mediante observación microscópica. Se conservaron a 4 °C en agar YGC inclinado. Se caracterizaron por su capacidad para fermentar melibiosa en caldo melibiosa/púrpura de bromocresol (hidrolizado enzimático de caseína 1%; extracto de levaduras 0,15%; NaCl 0,5%; melibiosa 1%; púrpura de bromocresol 0,015 g/l; pH : 6,8-7,2) incubados hasta 7 días a 20°C. Se evaluó la capacidad floculante de los aislamientos mediante protocolo adaptado del Ensayo de Helms: cultivos de 48 hs en caldo YPD (extracto de levadura 1%, peptona 2%, dextrosa 2%) fueron centrifugados y lavados 2 veces con EDTA 250 mM, luego con NaCl 250 mM pH 2,0 y lavado y re-suspensión final en NaCl 250 mM pH 4,5. Se homogeneizaron por vortex durante 5 minutos y 1,5 ml de cada suspensión se dispuso en cubetas adecuadas para lectura en Spectronic 20 (Thermo Scientific); se agregaron 60 μl de CaCl2 100 mM por cubeta y se homogeneizó en vortex durante 5 minutos antes de comenzar la lectura de DO550 cada 5 minutos durante 1 hora. Se estudió el efecto de aplicar 2 ciclos sucesivos de congelamiento (15 min, -80°C)/descongelamiento (5 min, 37°C) en la viabilidad de cultivos de 48 hs en caldo YPD lavados con H2O destilada estéril y re-suspendidos en distintos tratamientos (agua estéril; glicerol 2M; trehalosa 0,3M; leche estéril; trehalosa 0,3M en leche; sacarosa 0,3M en leche), realizando recuento de colonias pre y post aplicación de los ciclos en agar YGC (incubación 48hs a 30°C). Resultados y DiscusiónA partir de 6 sobres de levadura comercial liofilizada se obtuvo un total de 18 aislamientos de levaduras morfológicamente distinguibles. La mayoría de los aislamientos demostraron ser no fermentadores de melibiosa, y solo dos de ellos se presentaron como fermentadores lentos (de 5 a 7 días para acidificación del medio y presencia de gas en campana).Los tratamientos de criopreservación aplicados a un aislamiento tipo ale no mostraron diferencias significativas en cuanto a viabilidad, logrando en todos los casos mantener el orden de recuento inicial luego de dos ciclos de congelamiento/descongelamiento. Tanghe et al. (2002) proponen una correlación entre la crio-resistencia observada en ciertas cepas de S. cerevisiae aisladas de panadería y la expresión de acuaporinas de membrana citoplasmática. Un flujo de agua rápido y osmoregulado hacia el exterior durante el congelamiento reduciría la formación de cristales y el consecuente daño celular. Este mecanismo podría explicar la criotolerancia de cepas S. cerevisiae de cervecería.En cuanto a capacidad floculante, se evaluaron dos consorcios comerciales y sus aislamientos. El consorcio comercial para producción de cervezas característicamente turbias, no evidenció disminución de la DO550 en el tiempo ensayado, al igual que sus aislamientos. Por otro lado, el consorcio para producción de cervezas tipo ale, típicamente floculantes, reportó disminución de la DO550 en el tiempo de ensayo; no así los aislamientos obtenidos a partir de él. Esta última oservación podría explicarse a través de un mecanismo de co-floculación que, a diferencia de la floculación homotípica (intracepa), se describe como un proceso de agregación heterotípica entre dos cepas, una de ellas no-floculante y la otra débilmente floculante; cuando se combinan ambas en presencia de Ca2+ agregan en corto tiempo (Soares, 2010). ConclusionesDe acuerdo a lo observado en nuestros ensayos, los liofilizados de levadura cervecera comerciales están constituidos por más de una cepa de levadura, que se diferencian no sólo en su morfología macroscópica sino también por su capacidad de fermentar melibiosa y sus características floculantes. Los resultados aportan datos para la construcción del cepario de levaduras cerveceras criopreservadas, y serán complementados con próximos ensayos de viabilidad y vitalidad de cepas sometidas a un mayor número de ciclos sucesivos de congelamiento/descongelamiento. Por otro lado, las observaciones realizadas respecto a las propiedades floculantes de los consorcios comerciales y sus aislamientos serán de utilidad en la obtención de nuevos consorcios de levaduras nativos que aporten a la diferenciación competitiva del polo cervecero platense.Bibliografía Bolla, P.A., Serradell, M.A., de Urraza, P.J., De Antoni, G.L. (2011). Effect Of Freeze-Drying On Viability And In Vitro Probiotic Properties Of A Mixture Of Lactic Acid Bacteria And Yeasts Isolated From Kéfir. Journal of Dairy Research, 78, 15?22. Kurtzman, C.P., Fell, J.W., Boekhout, T. (2011). The Yeasts: A Taxonomic Study. Fifth Edition. Ámsterdam: Elsevier Science.Soares, E.V. (2010). Flocculation in Saccharomyces cerevisiae: A Review. Review Article, Journal of Applied Microbiology, 110, 1?18.Tanghe, A., Van Dijck, P., Dumortier, F., Teunissen, A., Hohmann, S., Thevelein, J.M. (2002). Aquaporin Expression Correlates with Freeze Tolerance in Baker?s Yeast, and Overexpression Improves Freeze Tolerance in Industrial Strains. Applied And Environmental Microbiology, 68(12), 5981?5989.