IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Modulación de la bomba de calcio de membrana plasmática: Efecto de los fosfolípidos ácidos y la calmodulina sobre la interacción con ATP
Autor/es:
NICOLÁS SAFFIOTI; JUAN PABLO ROSSI; MARIELA FERREIRA-GOMES; IRENE MANGIALAVORI
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Jornada; Jornadas Conciencia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica; 2013
Institución organizadora:
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Resumen:
La bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) transporta el calcio citoplasmático hacia exterior celular contra gradiente electroquímico. La energía necesaria para este transporte es obtenida de la hidrólisis de ATP. La PMCA pertenece a las P-ATPasas, una familia cuya característica principal es la formación de un intermediario de reacción fosforilado. Al igual que el resto de las P-ATPasas, posee un dominio hidrofóbico formado por 10 hélices transmembrana y 3 dominios citoplasmáticos: N (o de unión a nucleótido); A (o activador) y P (o de fosforilación). A diferencia de otros miembros de la familia, la PMCA posee un dominio C-terminal auto-inhibitorio. La unión del complejo Ca2+-Calmodulina (Ca2+-CaM) a dicho dominio produce un cambio conformacional que activa la enzima. Los fosfolípidos ácidos también regulan la actividad de la bomba y al igual que el complejo Ca2+-CaM, producen un aumento de la afinidad por Ca2+ y de la velocidad máxima de transporte. Experimentos preliminares (1) muestran que la unión de estos moduladores producen cambios en la región transmembrana de la PMCA. El mecanismo de acción aún no ha sido bien esclarecido, ya que se desconoce si el efecto de estos moduladores involucra también cambios en el dominio de unión a ATP. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto de moduladores sobre la afinidad de la PMCA por el ATP, utilizando un análogo fluorescente de este (trinitrofenil ATP, TNP-ATP). Para ello, la PMCA fue purificada a partir de eritrocitos humanos (2) y se determinó la actividad Ca2+-ATPasa (3) en función de la concentración de TNP-ATP en presencia y ausencia de CaM o fosfatidilserina. Mediante la cuantificación de la fluorescencia del TNP-ATP (4), se estudió el efecto de CaM sobre la conformación del dominio N. Los resultados muestran que (a) la unión de calmodulina produce un cambio conformacional del dominio N; (b) el TNP-ATP no es hidrolizado por la PMCA; (c) el TNP-ATP se comporta como un inhibidor competitivo del ATP y (d) las constantes de inhibición para el TNP-ATP (KTNP-ATP) a 2mM ATP en ausencia de modulador, en presencia de CaM y en presencia de fosfatidilserina fueron: 1.7 ± 0,4 µM; 2.1 ± 0,5 µM y 1,4 ± 0,2 µM, respectivamente. Estos resultados muestran que los cambios conformacionales en el dominio N producidos por los moduladores de la PMCA, no modifican la afinidad de la enzima por el ATP. Referencias (1) Mangialavori, I and Villamil-Giraldo, AM (2011) J Biol Chem. 286, 18397-18404 (2) Filomatori, C. V. and Rega, A. F. (2003) J Biol Chem. 278, 22265-22271 (3) Fiske, C.H. & Subbarow Y. (1925) J Biol Chem. 179, 66-71 (4) Mangialavori, I. Ferreira Gomes, M. Saffioti, N. González Lebrero, R. Rossi, R.C. and Rossi, J.P (2013) J Biol Chem. In press