Obtención de Variabilidad Genética en los Tetraploides Sexuales de Paspalum notatum a partir de los Ecotipos Tetraploides Apomicticos

ZILLI ALEX LEONEL; BARONE JAVIER ORLANDO; RIOS ESTEBAN FERNANDO; ACUÑA CARLOS ALBERTO; MARTINEZ ERIC JAVIER

Jornada; XX Jornada de Jovenes Pesquisadores de AUGM; 2012

Introducción Paspalum notatum Flüggé es una gramínea perenne, rizomatosa y nativa del continente americano, constituyendo una fracción importante de la oferta forrajera de numerosos sistemas pastoriles. Fue introducida a los Estados Unidos como especie forrajera y hoy día representa uno de los cultivos forrajeros más importantes de ese país (Blount & Acuna 2009). Además es extensamente cultivada como césped y también como forraje en Australia y Japón. La especie presenta distintos niveles de ploidía, encontrándose citotipos diploides (2n=2x=20) de reproducción sexual y alógamos por autoincompatibilidad (Burton 1955), tetraploides (2n=4x=40) que se reproducen por apomixis apospórica y seudogamia (Burton 1948), triploides y pentaploides (Tischler & Burson 1995). Los citotipos tetraploides presentan una distribución geográfica amplia, que va desde México hasta Argentina, mientras que los diploides se encuentran en un área acotada del litoral argentino. Evidencias genéticas y citogenéticas indican que todas las razas poliploides son de origen autoploides (Forbes & Burton 1961; Quarin et al. 1984; Stein et al. 2004). La apomixis es un tipo de reproducción asexual a través de verdaderas semillas (Nogler 1984). Este modo reproductivo da como resultado una progenie idéntica al genitor femenino, lo que impide la obtención de variabilidad genética. El mejoramiento genético por hibridación de una especie apomíctica requiere contar con individuos sexuales de igual nivel de ploidía para poder realizar los cruzamientos y obtener híbridos fértiles. En la naturaleza nunca se encontraron plantas tetraploides sexuales de P. notatum. Existen unos pocos genotipos tetraploides sexuales obtenidos experimentalmente a partir de duplicación cromosómica de individuos diploides (Forbes & Burton 1961; Quarin et al. 2001; Quesenberry et al. 2010). Algunos de estos genotipos tetraploides sexuales están muy estrechamente emparentados entre sí, lo cual reduce su base genética para poder utilizarlos en un programa de mejoramiento de la especie. En la naturaleza, existe disponible una fuente de diversidad genética muy amplia entre los ecotipos tetraploides apomícticos de P. notatum, la cual puede ser utilizada para aumentar el pool génico del germoplasma tetraploide sexual. Las plantas apomícticas producen polen meióticamente reducido y fértil; por lo tanto, pueden ser utilizadas como progenitores masculinos en hibridaciones con plantas sexuales del mismo nivel de ploidía. Cuando una planta sexual es cruzada con una planta apomíctica heterocigota, la diversidad genética contenida en los apomícticos es liberada y expresada en la progenie F1. Estas progenies segregan para el modo de reproducción, generando descendientes sexuales y apomícticos con nuevas combinaciones génicas. Estos individuos sexuales pueden ser seleccionados e inter-cruzados para obtener una población tetraploide sexual sintética con una base genética amplia. El objetivo del presente trabajo fue generar diferentes familias híbridas de P. notatum, segregantes para el modo de reproducción, con la finalidad de incrementar la variabilidad genética en el germoplasma tetraploide sexual de la especie. Materiales y Métodos: Material vegetal: Se utilizaron como madres genotipos tetraploides sexuales de P. notatum obtenidos experimentalmente, ya sea por duplicación cromosómica con colchicina de una planta diploide (C4-4x) (Quarin et al. 2001), o de origen híbrido (Q4205) (Quarin et al. 2003). También se empleó como madre un genotipo tetraploide apomíctico facultativo (Q3664), el cual posee un alto grado de expresión sexual (Ortiz et al. 1997). Se emplearon como padres plantas tetraploides apomícticas de diferentes orígenes geográficos y fenotípicamente variables. En la Tabla 1 se detallan los progenitores utilizados. Se realizaron cruzamientos controlados, mediante emasculación de las plantas usadas como madres y posterior polinización con el progenitor masculino. Las plantas obtenidas fueron primero cultivadas en invernadero y luego llevadas a campo. Accesión Reproducción Origen C&A1556 Apomixis Argentina, Buenos Aires, Ruta 35, Km. 364 cerca de Olavarría Q3838 Apomixis Argentina, Corrientes, Riachuelo. V14327 Apomixis Brasil, RS, Capivari. Q4040 Apomixis Brasil, SP, Nova Odessa. Q3775 Apomixis México, Tamaulipas. Q4064 Apomixis Argentina, Corrientes Saladas. SV2893 Apomixis Perú, Dpto. Cajamarca, Prov. Cajabamba, El Huayo, 2100 msm. Q3776 Apomixis Bolivia, Villa Tunari, Región del Chapare. Q4294 Apomixis Argentina, Córdoba, Sta. Rosa de Calamuchita, Los Algarrobos. B229 Apomixis Brasil, RS, Itaqui. TB86 Apomixis Uruguay, Ruta 26, Km. 389, Dpto. Cerro Largo. Q3664 Sexual USA, GA, Tifton (origen experimental). Q4205 Sexual Argentina, Corrientes (origen experimental). C4-4X Sexual Argentina, Corrientes (origen experimental). Origen híbrido de la progenie: Para evaluar la eficiencia de los cruzamientos se confirmó el origen híbrido de las progenies, sobre una muestra del 20 % de la población (10 plantas por familia), a partir del uso de marcadores moleculares de ISSR. Primero se realizó una selección de primers informativos con los diferentes progenitores a fin de seleccionar los que amplificaban bandas específicas del padre que estaban ausentes en la madre. Luego, se evaluó la presencia de dichas bandas específicas del padre en los respectivos descendientes (Figura 2). Se consideraron híbridos aquellas plantas que amplificaron 2 o más bandas específicas del padre apomíctico. Se empleó el protocolo descrito por Cidade et al. (2009) para la obtención de los amplicones. Los productos de amplificación fueron separados electroforéticamente en geles de agarosa al 2% (TAE 1X) a 60 W durante 3 h, teñidos con bromuro de etidio (1 mg/ml), y documentados mediante un sistema de análisis de imágenes denominado GelDoc-It® Imaging System (UVP). Determinación del modo reproductivo: Se realizó una primera clasificación con la totalidad de las progenies obtenidas, en base a la presencia/ausencia de un marcador molecular de RAPD 100 % ligado a la apomixis en P. notatum (Martínez et al. 2003) y luego se corroboraron estos resultados, sobre una muestra del 15%, mediante la técnica de clarificado de ovarios de Young et al. (1979) y posterior visualización de los sacos embrionarios a través de un microscopio con contraste de interferencia diferencial (DIC). Se analizaron entre 20 y 30 ovarios por planta. El protocolo para la obtención de los RAPDs fue el mismo empleado por Martínez et al. (2003). Las plantas que amplificaron el fragmento ligado a la apomixis y a su vez mostraron sacos embrionarios apospóricos fueron clasificadas como apomícticas; mientras que aquellas que no amplificaron dicho fragmento y a su vez mostraron sacos de origen meiótico fueron clasificadas como de reproducción sexual. Resultados y Discusión Se obtuvieron 14 combinaciones (familias) diferentes con un total de 590 individuos (Tabla 2). Se confirmó el origen híbrido de 7 de las 14 familias. En total, se evaluaron 70 descendientes los cuales amplificaron entre 2 y 7 bandas específicas del padre. No se detectaron descendientes originados por autofecundación. Esto demuestra que todos se originaron por hibridación y que los mismos son hijos de los padres apomícticos empleados El análisis del modo de reproducción, mediante el uso del marcador de RAPD, fue realizado en 8 de las 14 familias (Figura 3); mientras que el análisis citoembriológico, a partir de la observación de los sacos embrionarios (Figura 4), fue realizado en la totalidad de las familias. Se observaron rangos de segregaciones que van desde 1:1 a 6,1:1, sexual vs. apomixis (Tabla 2). En general, estos resultados coinciden con estudios anteriores realizados en la especie que mostraron distorsiones en las segregaciones a favor de la sexualidad en el orden de 3:1 (Martínez et al. 2001) a 6,5:1 (Stein et al. 2004). Esta distorsión fue explicada por un mecanismo de letalidad gamética del propio alelo de la apomixis, con penetrancia variable, o a factores ligados al carácter (Martínez et al. 2001). Sin embargo, en este trabajo se obtuvo una familia que segregó 1:1, sexual vs. apomixis. Esta segregación observada coincide con la esperada de 1:1 o 15:13, sexual vs. apomixis, siendo la apomixis un carácter monogénico y dominante, con herencia tetrasómica y segregación al azar de los cromosomas o de las cromátides, respectivamente. Conclusiones  Todos los descendientes evaluados se originaron por hibridación lo que demuestra la efectividad de los cruzamientos realizados.  La clasificación reproductiva realizada con el marcador de RAPD fue confirmada por análisis citoembriológico lo que demuestra su utilidad como método de detección temprana de plantas sexuales y apomícticas.  La obtención de una segregación 1:1, sexual vs. apomixis es un dato inédito que demuestra que la distorsión en la segregación no siempre se produce y que posiblemente dependa del genotipo apomíctico empleado en los cruzamientos.  La alta proporción de híbridos sexuales obtenidos en la mayoría de las combinaciones garantizan la generación de una población tetraploide sexual sintética con una base genética amplia.