INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
Nueva matriz cromatográfica a base de quitina para la purificación de lisozima de clara de huevo en una sola etapa
Autor/es:
FEDERICO J. WOLMAN; GUILLERMO J. COPELLO; ANDREA M. MEBERT; AGUSTÍN A. NAVARRO DEL CAÑIZO; LUIS E. DÍAZ; OSVALDO CASCONE
Lugar:
Buenos Aires, Argentina
Reunión:
Congreso; XII Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial, X JorFyBi; 2009
Institución organizadora:
SAFYBI
Resumen:
IntroducciónUno de los desafíos del downstream processing es contar con matrices cromatográficas que maximicen tanto los parámetros termodinámicos (alta capacidad de adsorción, adecuada afinidad del ligando por la proteína de interés y eficiente elución de la proteína adsorbida) como los hidrodinámicos. Asimismo, la relación performance/costo resulta crítica al momento de evaluar su utilidad en procesos de recuperación y purificación de bioproductos. Respecto de los aspectos hidrodinámicos, no todas las matrices comerciales resultan adecuadas cuando se trata de aislar un producto en muestras complejas como es el caso de la lisozima a  partir de clara de huevo. En este sentido y tomando la lisozima de clara de huevo como modelo de estudio, se desarrolló una matriz cromatográfica de afinidad a base de un copolímero de quitina y óxido de silicio (utilizando como monómero precursor tetraetoxisilano, TEOS), tal que satisfaga los requerimientos mencionados. Materiales y Métodos   La matriz se sintetizó inmovilizando un hidrogel de quitina 5% en un polímero de óxido de silicio. El hidrogel se obtuvo por solubilización de quitina en metanol saturado con CaCl2. El exceso de CaCl2 se eliminó mediante lavados con agua destilada. Como precursor polimérico se utilizó TEOS, al que se hidrolizó en medio ácido. Posteriormente se mezclaron partes iguales de ambas soluciones y se dejó gelificar. Los geles se seccionaron en perlas de 1 mm de diámetro y se les permitió envejecer a temperatura ambiente para alcanzar una resistencia mecánica adecuada. Las isotermas de adsorción se realizaron en batch. 50 mg de matriz se enfrentaron a concentraciones crecientes de solución de lisozima en tubos eppendorf (0 a 10 mg/ml en buffer de fosfatos 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM). La cantidad de proteína adsorbida se determinó como la diferencia entre la concentración original en cada tubo y la remanente en el sobrenadante una vez que el sistema alcanzó el equilibrio. Los parámetros termodinámicos se calcularon a partir del ajuste según Langmuir. Los procesos de purificación a partir de clara de huevo se realizaron en batch. 1 g de matriz se dejó en agitación con 10 ml de clara de huevo (sin previa dilución), se realizaron 3 lavados con buffer de fosfatos 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM y la proteína adsorbida se eluyó por tratamiento con ácido acético 0,1 M. La performance del proceso se evaluó por medición de la actividad de la lisozima.  Resultados La matriz desarrollada mostró una capacidad de adsorción máxima para lisozima de 117,1 ± 9,0 mg/g y una constante de disociación de 0,7 ± 0,1 mg/g. Dado que la cinética del proceso adsortivo y las características del material de partida no permiten la cromatografía en columna, el proceso se realizó en un sistema batch. Los estudios de purificación de la lisozima a partir de clara de huevo, mostraron una adsorción del 95% de la proteína a partir de la fuente de origen y la eficiente elución de la misma, con un factor de purificación de 71 y un rendimiento global del proceso del  70%. Conclusiones La técnica descripta permitió inmovilizar quitina en una matriz de SiO2 rígida y porosa que permite la agitación mecánica sin deterioro en el proceso de adsorción y posibilita su sencilla remoción del medio de interacción, lo que resulta crítico dada la viscosidad de la muestra.La matriz propuesta permite purificar lisozima directamente de clara de huevo con alta eficiencia y sin inutilizar el material de partida, que puede derivarse a sus usos originales en alimentación humana
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