INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de una nueva matriz de afinidad a base de quitina para la purificación de lisozima de clara de huevo en una sola etapa
Autor/es:
MARÍA F. BAIELI; GUILLERMO J. COPELLO; ANDREA M. MEBERT; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; MARÍA V. MIRANDA; AGUSTÍN A. NAVARRO DEL CAÑIZO; LUIS E. DÍAZ; OSVALDO CASCONE; FEDERICO J. WOLMAN
Lugar:
CABA
Reunión:
Congreso; ETIF 2010; 2010
Institución organizadora:
ETIF
Resumen:
Uno de los desafíos del downstream processing es contar con matrices cromatográficas que maximicen parámetros tales como la capacidad de adsorción, la adecuada afinidad del ligando por la proteína de interés y la eficiente elución de la proteína adsorbida. No todas las matrices comerciales resultan adecuadas cuando se trata de aislar un producto a partir de muestras complejas, las elevadas viscosidades y la presencia de material particulado, pueden demandar etapas de clarificación y/o acondicionamiento de la muestra previas al proceso de purificación. Tal es el caso de la lisozima a partir de clara de huevo. Asimismo, la relación performance/costo resulta crítica al momento de evaluar su utilidad en procesos de recuperación y purificación de bioproductos. En este sentido y tomando la lisozima de clara de huevo como modelo de estudio, se desarrolló una matriz cromatográfica de afinidad de bajo costo. La misma fue sintetizada a base de un copolímero de quitina y óxido de silicio (utilizando como monómero precursor tetraetoxisilano, TEOS), permitiendo la purificación de esta proteína en una única etapa y sin necesidad de acondicionamiento previo de la muestra. Materiales y Métodos La matriz se sintetizó inmovilizando un hidrogel de quitina 5% en un polímero de óxido de silicio. El hidrogel se obtuvo por solubilización de quitina en metanol saturado con CaCl2. El exceso de CaCl2 se eliminó mediante lavados con agua destilada. Como precursor polimérico se utilizó TEOS, al que se hidrolizó en medio ácido. Posteriormente, se mezclaron partes iguales de ambas soluciones y se dejó gelificar. Los geles se seccionaron en perlas de 1 mm de diámetro y se les permitió envejecer a temperatura ambiente para alcanzar una resistencia mecánica adecuada. Las isotermas de adsorción se realizaron enfrentando 50 mg de matriz con concentraciones crecientes de solución de lisozima (0 a 10 mg/ml en buffer de fosfatos 50 mM, pH 8, NaCl50 mM). La cantidad de proteína adsorbida se determinó como la diferencia entre la concentración original en cada tubo y la remanente en el sobrenadante una vez que el sistema alcanzó el equilibrio. Los parámetros termodinámicos se calcularon a partir del ajuste según Langmuir. Los procesos de purificación a partir de clara de huevo se realizaron en batch. Se dejó en agitación 1 g de matriz con 10 ml de clara de huevo (sin previa dilución), se realizaron 3 lavados con buffer de fosfatos 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM y se ensayaron 3 condiciones de elución: a) ácido acético 0,1 M; b) 0,3M NaCl en buffer de carbonatos 0,1M pH 9,6; y c) 2M NaCl + 25 % etilénglicol en buffer de fosfatos 50 mM pH 8. La performance del proceso se evaluó por medición de la actividad de la lisozima. Resultados La matriz desarrollada mostró una capacidad de adsorción máxima para lisozima de 117,1 ± 9,0 mg/g y una constante de disociación de 0,7 ± 0,1 mg/g. Dado que la cinética del proceso adsortivo y las características del material de partida no permiten la cromatografía en columna, el proceso se realizó en un sistema batch. Los estudios de purificación de la lisozima a partir de clara de huevo, mostraron una adsorción del 87% de la proteína a partir de la muestra original y una eficiente elución de la misma, con un factor de purificación de 20 y un rendimiento global del proceso del 64% para el eluyente ácido acético 0,1M. Conclusiones La técnica descripta permitió inmovilizar quitina en una matriz de SiO2 rígida y porosa que permite la agitación mecánica sin deterioro en el proceso de adsorción de la proteína de interés y posibilita su sencilla remoción del medio de interacción, lo que resulta crítico dada la viscosidad de la muestra. La matriz propuesta permitió purificar lisozima directamente de clara de huevo con alta eficiencia y sin inutilizar el material de partida, que puede derivarse a sus usos originales en alimentación humana.
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