Estandarización de una técnica de PCR en materia fecal para diagnóstico de nematodes intestinales sin requerimientos de kits comerciales.

REPETTO, S; ALBA-SOTO, CD; CHIODO, P; CUELLO, MS; BASUALDO, J; TEKIEL, V; GONZALEZ-CAPPA, S.M.

Santa Fe

Congreso; XXIII Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología.; 2009

Soc. Arg de Protozoología

<!-- /* Font Definitions */ @font-face {font-family:"Times New Roman"; panose-1:0 2 2 6 3 5 4 5 2 3; mso-font-alt:"Trebuchet MS"; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:50331648 0 0 0 1 0;} @font-face {font-family:Verdana; panose-1:0 2 11 6 4 3 5 4 4 2; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:50331648 0 0 0 1 0;} /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-ansi-language:ES-AR;} p.MsoCommentText, li.MsoCommentText, div.MsoCommentText {margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-ansi-language:ES;} span.MsoCommentReference {font-size:9.0pt;} @page Section1 {size:612.35pt 28.0cm; margin:62.35pt 3.0cm 62.35pt 3.0cm; mso-header-margin:42.55pt; mso-footer-margin:34.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> El objetivo fue poner a punto la extracción de ADN de nematodes de heces (H) y posterior PCR sobre estas muestras para diagnosticar nematodiasis. Éstas se diagnostican por enriquecimiento de H y microscopía. La sensibilidad es  baja y por ello las técnicas moleculares pueden ser útiles. Los métodos comunicados usan kit comerciales de purificación de ADN por las dificultades en su extracción debido a la estructura de la cutícula del parásito y por los inhibidores en H que interfieren en la PCR.. Para    resolver esto se realizaron ensayos con nematodes y H, empleando adultos frescos de Ascaris lumbricoides (A.l) y larvas frescas de Toxocara canis (T.c) liberadas in vitro de huevos de hembras recuperadas de H de perro. Se purificó ADN de: a) 1g de  A.l ; b) 1g de A.l  más  0,5g H humanas no parasitadas: c) 400 larvas de T.c. Luego de ensayar varios protocolos, se describe el que resultó efectivo. Las muestras se incubaron a  temperatura ambiente en GTES (100 mM glicina, 0,05% SDS, 10mM Tris/HCL, pH 8 y 1mM EDTA 0,5 M) por 12 h, se lisaron mecánicamente (N2 líquido y sonicación) e incubaron a  37 C otras 12 h con  buffer de lisis (100mM EDTA, 100mM NaCl, 100mM Tris pH 7,5 y 0,5% SDS, Proteinasa K 100 µg/ml). Se trataron dos veces con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) para extraer proteínas y el ADN se precipitó con 2,5 vol etanol 100%. El sedimento se lavó con etanol 70% y su concentración y pureza se verificaron por espectrofotometría. En las PCR de a), b) y c) se usaron cebadores específicos. En una cuarta muestra se combinó ADN de T.c (c) más ADN de A.l con H l (b) y se amplificó con cebadores para T.c. Para la amplificación se usaron 5μl de ADN, más BSA 2,5μg, 2mM de Mg2, 0,5μM de cada cebador, 0,4μM de DNTPs y 0,01U/μl de Taq polimerasa en un vol final de 20 μl. El ciclado fue a 95 C tres min, seguidos de 35 ciclos de 95 C por cinco seg, 55 C un min y 72 C cuarenta y cinco seg y finalmente, 72 C cinco min. Se ensayaron muestras paralelas sin BSA. El rendimiento de ADN (μg/ml) fue: a)1,12, b) 7,78 y c) 0,176l. La relación 260/280 fue 1,7-1,8. En ausencia de BSA no se observó amplificación de ADN. Cuando se incluyó, se identificaron en a) y b) una banda de 164 bp correspondientes a A.l (rRNA 18S) y en c) y d) una banda de 364 bp correpondientes a T.c (rRNA18S). Concluimos: el tratamiento de nematodes con GTES y posterior lisis mecánica y química permite obtener ADN de calidad a partir de muestras contaminadas con H y la inclusión del BSA en las PCR neutraliza inhibidores contaminantes presentes en H. Esta metodología podría aplicarse para otras nematodiasis, como estrongiloidosis.