Caracterización fenotípica de mutantes por deleción para TSSA (Trypomastigote Small Surface Antigen) de T. cruzi.

BURASI, F; CAMARA, MDM; RODRIGUEZ, ME; TEKIEL, V; BUSCAGLIA, C; BALOUZ, V

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Congreso; XXXII Reunión Anual Soc Arg Protozool.; 2020

Sociedad Argentina de Protozoología

#62 - Caracterización fenotípica de mutantes por deleción para TSSA (Trypomastigote Small Surface Antigen) de Trypanosoma cruzi● Burasi, Florencia (Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ‘Dr Rodolfo Ugalde’(IIBio), UNSAM - CONICET) florenciaburasi@gmail.com● Cámara, M. (IIBio (UNSAM-CONICET))● Rodriguez, M. E. (IIBio (UNSAM-CONICET))● Tekiel, V. (IIBio (UNSAM-CONICET))● Buscaglia, C. A. (IIBio (UNSAM-CONICET))● Balouz, V. (IIBio (UNSAM-CONICET))TSSA es una proteína polimórfica de la superficie de T. cruzi, involucrada en la adhesión a células blanco previo a la internalización. Para estudiar el rol de esta molécula generamos mediante CRISPR/Cas9 parásitos de la cepa RA editados en el locus TSSA, compuesto por 12 copias idénticas dispuestas en tándem. Obtuvimos 3 clones con diferentes genotipos: #3 con deleción parcial del locus TSSA, #9 y #10 con deleción total del locus y de distintas regiones flanqueantes. Los clones #9 y #10 mostraron una infectividad menor (~50%) in vitro (e in vivo en el caso del clon #9) y una menor transmigración en un modelo de esferoides celulares. En este trabajo se evaluó si este último fenotipo está relacionado con deficiencias en la motilidad de los clones editados. Para esto, realizamos ensayos de migración en medio líquido y matrices semisólidas de colágeno tipo I. Se grabaron videos y usando un software específico se realizó el seguimiento manual de los parásitos cuadro por cuadro. En ninguna condición vimos diferencias significativas entre los clones y la cepa RAwt en los valores de velocidad obtenidos ni en el tipo de movimientos. Por esto inferimos que TSSA no cumple un rol crucial en el movimiento mecánico del tripomastigote per se sino que la disminución de los niveles de transmigración de los clones #9 y #10 (TSSA KO) podría estar relacionada con deficiencias en su interacción con receptores en la superficie de las células o de la matriz. Para confirmar que la menor infectividad se debía a la edición génica de TSSA, realizamos complementación funcional. Genes para distintas isoformas de TSSA con un epítope FLAG (y resistentes a edición por Cas9) fueron sintetizados, clonados en pTEX y transfectados en parásitos mutantes y RA wt. Ensayos de Western blot e IFI permitieron verificar la correcta expresión de las TSSA ectópicas en epimastigotes de las distintas líneas, los cuales serán próximamente diferenciados in vitro a tripomastigotes y evaluados fenotípicamente.