Purificación parcial de una esterasa producida por Bacillus licheniformis S-86

TORRES SEBASTIÁN; RODRÍGUEZ EMILIO; CASTRO GUILLERMO R.

Tafí del Valle, Tucumán. Argentina.

Jornada; XX Jornadas Científicas de la Asociación de Biología de Tucumán; 2003

Asociación de Biología de Tucumán

Las esterasas han despertado un gran interés por su capacidad para sintetizar nuevos compuestos de interés industrial. Entre las reacciones llevadas a cabo por estas enzimas se incluyen la resolución de mezclas racémicas, hidrólisis enantio- y regio-selectiva de ésteres y síntesis de fármacos naturales y no naturales. La gran mayoría de estas reacciones se efectúan en solventes no acuosos; sin embargo, una de las principales desventajas de la catálisis en sistemas no acuosos es la inactivación de las enzimas. En nuestro laboratorio fue aislada una cepa resistente a mezclas de solventes no acuosos, B. licheniformis S-86, la cual es capaz de producir esterasas resistentes a solventes orgánicos. El objetivo del presente trabajo fue la purificación de las esterasas producidas por B. licheniformis S-86. Materiales y métodos: la producción de las enzimas se realizó en un fermentador con un volumen de trabajo de 400 ml, mediante cultivo en lote a 50 ºC con inyección de aire. Se utilizó un medio de cultivo salino suplementado con peptona (2,5 g/l), extracto de levadura (1,5 g/l), maltosa (10,0 g/l) y aceite de oliva (0.1% v/v). La actividad enzimática se determinó utilizando p-nitrofenil acetato como sustrato. La concentración de proteínas se determinó mediante Coomassie blue G-250. La purificación se realizó en tres pasos: el extracto crudo libre de células fue precipitado con acetona 50% y el precipitado resuspendido en buffer Tris HCl 100 mM (pH 7); esta solución fue agregada a una columna de intercambio iónico DEAE-cellulosa equilibrada con el mismo buffer, y luego eluída con un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl. Las fracciones con actividad esterasa fueron mezcladas, concentradas y agregadas a la misma columna y eluídas con un gradiente lineal de 0 a 0,25 M de NaCl. Las fracciones conteniendo actividad esterasa fueron analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) (8%). Los zimogramas fueron revelados con alfa-naftil acetato y Fast Blue RR. Las proteínas se visualizaron con Coomassie brillant blue R-250 y mediante tinción de plata. El inhibidor PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) fue agregado para determinar enzimas con residuo serina en su sitio activo. Resultados: B. licheniformis S-86 produce dos esterasas de distinto peso molecular que fueron detectadas por PAGE; una de las esterasas (S-86 I) fue inhibida por PMSF, por lo que podría considerarse una enzima serino dependiente, mientras que la actividad de la otra esterasa no fue inhibida por PMSF (S-86 II). La precipitación con acetona 50% resultó en un rendimiento del 52%. En la primera cromatografía en DEAE-cellulose, la mayor actividad esterasa se recuperó en las fracciones eluídas entre 0,20 y 0,40 M. Estas fracciones fueron mezcladas y concentradas, obteniéndose un rendimiento del 32%. Los zimogramas revelaron que la actividad esterasa recuperada correspondía a la esterasa S-86 II. Las muestras concentradas fueron agregadas por segunda vez en la columna de DEAE-cellulose y las fracciones con actividad esterasa fueron eluídas entre 0,20 y 0,25M. En este último paso la esterasa S-86 II fue purificada 6,75 veces con una actividad específica de 6,54 U/mg y un rendimiento del 10%. Los extractos crudos de B. licheniformis S-86 presentaron una actividad esterasa elevada en mezclas de solventes orgánicos y una actividad óptima comprendida entre 65 y 70 ºC, características que hacen a estas enzimas atractivas para su uso industrial. Además la posibilidad de obtener estas enzimas en estado homogéneo permitiría su aplicación en síntesis de compuestos orgánicos de elevado valor agregado y de potencial uso farmacológico.