Identificación de una levadura aislada en la Provincia de Misiones y caracterización parcial de los extractos enzimáticos producidos con actividad macerante

MARTOS M.A; ZUBRESKI E.R.; COMBINA M.; VITA C.E.; HOURS R.A.

Cordoba, Argentina

Congreso; III Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CYTAL 2009).; 2009

Universidad Nacional de Cordoba, CONICET

Estudios previos demostraron que una levadura autóctona, aislada de frutas cítricas, produce extractos enzimáticos con capacidad macerante de tejidos vegetales (papa, mandioca, etc.). La maceración enzimática es muy utilizada en la industria alimenticia para la elaboración de alimentos no convencionales (para bebés, gerontes, etc.). El objetivo del presente estudio fue identificar dicha levadura por métodos moleculares y caracterizar su pool enzimático, a fin de poder identificar las actividades enzimáticas involucradas en la maceración. Se realizó PCR del fragmento 5.8S-ITS utilizando los primers ITS1 e ITS4, seguido de digestión con enzimas de restricción (Hinf I, Cfo I y Hae III). El fragmento amplificado fue secuenciado para confirmar su identidad. Para la obtención de los extractos enzimáticos, los cultivos se realizaron en Erlenmeyers de 500 ml,  agitados (150 rpm), a 30°C, durante 3 días, con 100 ml de un medio compuesto por glucosa y pectina de citrus como fuente de carbono y energía e inductor e YNB como fuente de nitrógeno. La biomasa se separó por centrifugación. Los extractos se liofilizaron, concentraron 10 × y desalaron en columna PD-10 (Pharmacia, Biotech) equilibrada con buffer AcONa (20 mM, pH 5,0). Las muestras se inyectaron en una columna MonoQ equilibrada con el mismo buffer y eluyeron con gradiente de NaCl (0-0,5 M). Se midieron actividades de: hidrolasas (poligalacturonasa (PGasa), celulasa, xilanasa) por determinación de grupos reductores liberados a partir de los correspondiente sustratos mediante el método DNS, liasa (pectinliasa y pectatoliasa) por incremento de A235 y pectinesterasa por cambio de A617 de un indicador de pH durante la reacción. El mecanismo de acción de PGasa (tipo endo o exo) se determinó mediante la relación entre la disminución de viscosidad de una solución de ácido poligalacturónico (APG) y el % de enlaces glicosídicos hidrolizados. Los productos de reacción de la hidrólisis se analizaron por cromatografía en capa fina. Los resultados de la identificación mostraron un 89% de homología en la secuencia de nucleótidos con diferentes aislados de Pichia anomala. Los extractos enzimáticos presentaron actividad PGasa, pero no se detectó actividad pectinliasa, pectatoliasa ni pectinesterasa. Tampoco se detectaron actividades degradadoras de polímeros de pared celular (celulasa y xilanasa). La cromatografía de intercambio catiónico reveló la presencia de dos picos individuales con actividad PGasa. La acción enzimática de PGasa fue de tipo endo: una marcada disminución (50%) de viscosidad (por disminución del PM del APG) para una hidrólisis reducida del sustrato. La cromatografía en capa fina reveló claramente que el APG es inicialmente degradado a oligómeros, confirmando la acción endo. Pichia anómala produce 2 isoenzimas con actividad PGasa, cuyo modo de acción es preferentemente del tipo endo, las cuales serían las responsables de la maceración de tejidos vegetales