Diseño y optimización de la extracción líquido-líquido de xilanasa fungica

TADDIA ANTONELA; LOUREIRO DANA BELÉN; TUBIO GISELA

Rosario

Jornada; IX Jornada de Ciencia y Tecnología; 2015

Universidad Nacional de Rosario

El objetivo de este trabajo fue utilizar el diseño estadístico experimental para determinar los factores que afectan significativamente el proceso y optimizar la extracción de xilanasa de Aspergillus niger a partir de sistemas bifásicos acuosos (SBAs) formados por polietilenglicol (PEG) y citrato de sodio (NaCit). Para estudiar la influencia de diversos parámetros se aplicó un diseño factorial completo con 6 puntos adicionales. El mismo incluyó a tres factores, de los cuales dos fueron variables cuantitativas: peso molecular de PEG (PMPEG) y concentración de NaCl o fuerza iónica (FI), evaluados a 3 niveles, y como variable categórica la composición total del sistema o la Línea de Unión, evaluada a dos niveles. Se analizó como variable respuesta el coeficiente de reparto de xilanasa (KrXyl), y los rendimientos en cada una de las fases (R%Fsup y R%Finf). Los SBAs madres se prepararon por pesada directa de PEG y NaCl, los que se mezclaron con la cantidad correspondiente de solución de NaCit a pH 5,20. Los SBAs preparados fueron agitados y dejados en reposo durante 24 horas de modo que alcanzasen el equilibrio de separación de fases a temperatura controlada y constante (22ºC). Luego se separaron las fases superior e inferior y con las mismas se reconstituyeron nuevos SBAs más pequeños de dos gramos totales (por triplicado) para ensayar sobre ellos el reparto de la enzima. Sobre los SBAs preformados se adicionaron alícuotas suficientemente pequeñas de la enzima, agitando en forma suave y se dejaron reposar durante 120 minutos. Alcanzado el equilibrio de reparto, se separaron las fases y se determinó la actividad enzimática, con el que se obtuvo el KrXyl, R%Fsup y R%Finf. Se midió actividad xilanasa empleando el método colorimétrico del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS), basado en la determinación de azúcares reductores. Como sustrato de reacción se utilizó una solución de xilano de haya al 1%P/P. Se realizó un cultivo de Aspergillus niger en medio Mandel, el cual emplea xilano como única fuente de carbono y minimiza la relación nitrógeno/carbono para la producción del complejo xilanolítico libre de enzimas celulolíticas. Los resultados obtenidos indican que los valores de KrXyl de xilanasa comercial son superiores a la unidad indicando una alta afinidad de la enzima por la fase superior rica en polímero. Solo el efecto de la LU resultó significativo (con 5% de significación) cuando se analizó R%Fsup que aumenta cuando se incrementa la LU. Se realizó un segundo análisis de las respuestas considerando un modelo factorial a dos variables (PMPEG y FI) y tres puntos centrales a dos niveles en el cual se asumió el mayor valor para la variable LU, donde el R%Fsup es prácticamente independiente del PMPEG y de la FI. Una disminución del PMPEG conduce a un menor R%Finf y en consecuencia, a un aumento en el R%Fsup. Del análisis, se concluye que el sistema más adecuado para la extracción de xilanasa el SBA de mayor LU formado por PEG 2000, NaCit pH 5,20 y NaCl 4%P/P a 22ºC. Posteriormente, los resultados se corroboraron con el reparto, sobre el SBA seleccionado, del filtrado del cultivo de Aspergillus niger que se empleo sin tratamiento previo. La enzima del filtrado siguió la misma tendencia que la enzima comercial, repartiéndose principalmente hacia la fase superior, con Kr mayores a la unidad, con un R% en dicha fase mayor al 75%, siendo el balance de masa del 97%; es decir, con poca pérdida enzimática, lo cual es deseable para un bioproceso en un solo paso extractivo.