Análisis estructural y funcional de xilanasa de Thermomyces lanuginosus a distintas temperaturas en presencia de PEGs de distintos pesos moleculares

TADDIA ANTONELA; MARCHISIO FIORELA; LOUREIRO DANA BELÉN; TUBIO GISELA

Rosario

Jornada; VIII Jornada de Ciencia y Tecnología.; 2014

Universidad Nacional de Rosario

Las xilanasas (Xyl) son enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces glicosídicos β-1,4 del xilano, polisacárido mayoritario en la pared celular de las plantas. Dichas enzimas son producidas por una gran cantidad de organismos. Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) es un hongo filamentoso capaz de producir xilanasa extracelular, lo cual facilita su obtención del caldo de cultivo. Algunas técnicas separativas, como los Sistemas Bifásicos Acuosos (SBA), emplean polímeros de cadena flexible (PCFs), siendo uno de los más comunes el polietilenglicol (PEG). Por ello, en el diseño de estrategias separativas en las que se utilicen PCFs es indispensable caracterizar estructural y funcionalmente a la enzima de interés en presencia de los mismos. La técnica espectroscópica Dicroísmo Circular (DC), proporciona información con respecto a la estructura de la proteína y de sus cambios conformacionales debidos a la presencia de dichos cosolutos en el medio.El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y de la presencia de PEGs de diferentes pesos moleculares (PM) sobre la estructura secundaria y la actividad enzimática de xilanasa de T. lanuginosus, para la posterior validación de técnicas de purificación que utilizan PEGs, como los SBAs. Para ello, se realizaron espectros de DC de Xyl de T. lanuginosus en un espectropolarímetro Jasco J-810. Los datos fueron registrados entre 195 y 240nm (UV lejano), luego de incubar la proteína durante 10 minutos a: 20, 40, 50, 60 y 70ºC, en ausencia y presencia de PEG de diferentes PM (1000, 2000, 4600 y 8000) al 5% P/P. La concentración final de proteína fue 0,23mM. Todos los espectros se corrigieron luego, por la contribución del control correspondiente (sin enzima); se analizaron y suavizaron con el programa informático Jasco Spectra Analysis. La actividad Xyl se determinó por el método del DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico) el cual es reducido a ácido 3-amino,5-nitro salicílico, de color rojo, por los azúcares reductores presentes en la muestra, producto de la hidrólisis de xilano. Los resultados obtenidos mostraron que la Xyl exhibe el comportamiento típico de un patrón lámina β con una banda positiva en 197?201nm y una banda negativa en 215?225nm, característico de esta glucosidasa. La presencia de PEG no produjo cambios significativos en los espectros a ninguna de las temperaturas ensayadas, salvo en presencia de PEG 1000, que a 60 y 70ºC mostraron pérdida total de la estructura secundaria. Por otro lado, se observó que la actividad enzimática de los distintos sistemas fue disminuyendo levemente con el aumento de la temperatura hasta 60ºC, mientras que a 70ºC la actividad disminuyó en, aproximadamente, un 30-50% con respecto a la actividad inicial, obteniéndose una actividad mínima en presencia de PEG 1000. Para cada temperatura ensayada, la presencia de PEGs de mayor PM mostró mayores valores de actividad Xyl. Los resultados obtenidos permiten concluir que, para la extracción de Xyl de T. lanuginosus de un cultivo fúngico, se podrían emplear SBAs formados con PEGs de alto PM y trabajar dentro de un rango amplio de temperaturas (hasta 60ºC), pudiendo obtener la proteína con buena actividad enzimática y conservando su estructura secundaria.