Identificación y caracterización molecular de un gen homólogo al gen Mi de resistencia a nematodos de tomate en la especie silvestre de papa Solanum kurtzianum

SEGURA D, SANCHEZ PUERTA V, LOPEZ LAMBERTINI P, MASUELLI R

Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXIII Congreso ALAP´08; 2008

Introducción El nematodo del nudo es una plaga del suelo que causa daños importantes en los cultivos de papa. Específicamente Meloidogyne incognita es la especie más relevante en zonas templado-cálidas. Este nematodo produce pérdidas de rendimiento, afecta la calidad de los tubérculos y además no cuenta con un método de control que sea efectivo, ambientalmente seguro y económicamente rentable. Una alternativa para su control es la incorporación de resistencia genética estable a esta plaga a través de mejoramiento clásico empleando especies silvestres relacionadas que sean resistentes al patógeno o bien a través de la incorporación por ingeniería genética del gen de resistencia. Hasta el momento no ha sido clonado en papa ningún gen de resistencia a Meloidogyne spp. Por otro lado, en tomate se ha clonado y caracterizado molecularmente el gen Mi que confiere resistencia a esta plaga. (Martinez de Ilarduya et al. 2001). Dado que las especies de tomate y papa poseen genomas similares, el objetivo de este trabajo es aislar y caracterizar un gen homólogo al Mi de tomate en la especie silvestre de papa Solanum kurtzianum, donde encontramos genotipos con resistencia a Meloidogyne. Materiales y métodos Se extrajo ADN de una planta tolerante a la infección con nematodos por el método Dellaporta (Dellaporta, 1983). Luego se diseñaron primers degenerados a partir de secuencias conservadas entre un EST (Expressed Sequence Tag) de S. tuberosum y el gen Mi de tomate para amplificar el gen homólogo al Mi en el genoma de S. kurtzianum. Posteriormente, para continuar con la dilucidación de la secuencia, se utilizó la técnica TAIL PCR (Thermal Asymmetric Interlaced). Ésta consiste en sucesivas reacciones de PCR utilizando primers específicos diseñados en la secuencia conocida del gen en estudio y primers universales (Esquema 1). Esquema 1: TAIL PCR. Las dos flechas de mayor tamaño representan una porción del genoma y el bloque gris sobre una de ellas un fragmento conocido del gen en estudio. P1, P2 y P3 son primers específicos diseñados a partir de la secuencia conocida, mientras que PA es un primer aleatorio. Se realiza una primera reacción de PCR con los primers P1 y PA, luego ésta se usa como molde para una reacción con los primers P2 y PA, para luego usarla como templado con los primers P3 y PA. Estas reacciones sucesivas darán como resultado una banda correspondiente al fragmento inmediatamente adyacente a la zona conocida del gen en estudio, mientras que las bandas inespecíficas no son tenidas en cuenta para el análisis. Resultados y discusión Con el uso de los primers degenerados se obtuvo un fragmento de 1.6 kb que después de ser clonado y secuenciado fue analizado usando la herramienta BLAST del NCBI. Este estudio arrojó como resultado una gran similitud con los extremos 3´ de genes de resistencia relacionados, como el gen Mi de tomate, de 4 kb (Milligan et al, 1998) y el gen de resistencia a Phytophthora infestans, Rpi-blb2, de S. bulbocastanum (van der Vossen, 2005). La secuencia obtenida corresponde a la zona LRR de la familia de genes de resistencia tipo NBS-LRR en plantas. Con la técnica TAIL PCR se lograron detectar varios fragmentos consecutivos hasta completar una gran parte del gen homólogo al gen Mi de tomate en S. kurtzianum. Específicamente se secuenciaron 3418 bp que, al analizarlos, siguen mostrando una gran homología con genes de resistencia a M. incognita (Tabla 1). Tabla 1. Análisis de homología de la secuencia de S. kurtzianum Gen ID % homología E. value Rpi-blb2 DQ122125.1 89 0.0 Mi 1.1 AF039681.1 88 0.0 Mi 1.2 U81378.1 88 0.0 Mi 1-C DQ863290.1 88 0.0 Mi 1-G DQ863293.1 88 0.0 Mi 1-F y Mi 1-E DQ863292.1 88 0.0 Hasta el momento no se ha caracterizado en papa un gen de resistencia a Meloidogyne incognita. Llevar a cabo este objetivo nos permitirá acelerar su transferencia a la papa cultivada, siendo ésta una manera de resolver la problemática previamente descripta. Referencias bibliográficas Dellaporta S., Wood J., Hicks J., 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology, Rep 1: 19-21. Martinez de Ilarduya O., Moore A. y Kaloshian I., 2001. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. The Plant Journal 27(5), 417-425. Milligan S., Bodeau J., Yaghoobi J., Kaloshian I., Zabel P. y Williamson V., 1998. The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper, nucleotide binding, leucine-rich repeat family of plant genes. The Plant Cell, Vol. 10, 1307-1319. Van der Vossen E., Gros J., Sikkema A., Muskens M.,Wouters D., Wolters P., Pereira A., Allefs S., 2005. The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato. The Plant Journal, 44, 208-222.