Expresión y actividad de E-NTPDasas en hepatocitos de trucha

PEREZ RECALDE, MERCEDES; FAILLACE, M. P.; PAFUNDO, D. E.; SCHWARZBAUM, P.J.

Mar del Plata, Argentina

Congreso; Joint Congress of Biochemical Societies; 2004

Sociedad Argentina de Biofisica

Las E-NTPDasas son enzimas de membrana que hidrolizan nucleósidos di- y trifosfato del medio extracelular. Entre sus funciones, estas enzimas podrían modular la regulación de volumen de células hepáticas. En hepatocitos de trucha la incubación en medio hipotónico induce aumento de volumen, seguido de una disminución volumétrica llamada RVD. Se postuló que el RVD puede ser mediado por ATP extracelular, y que la [ATP] puede ser modulada por E-NTPDasas En este trabajo se usaron hepatocitos de trucha para: 1) identificar E-NTPasas y caracterizar su actividad; 2) establecer su función durante el RVD. Como los nucleótidos son impermeables al hepatocito, la liberación de g 32P Pi de[g 32P ATP] exógeno permite estimar la actividad ATPásica de una E-NTPDasa, y la liberación de a32P Pi de [ a32 P ATP] exógeno permite verificar la presencia de ectoenzimas que desfosforilan totalmente el ATP. En presencia de 5 mM [g 32P ATP]  la actividad ATPásica fue 0.21±0.02 nmol./106 cels x min mientras que con 5mM a32 P ATP, la actividad fue 7.1±0.4x10-3 nmol/106 cels x min. La actividad ectoATPasa vs ATP (0.5 µM a 1 mM) mostró un K ½ de 246 ± 105 mM. Si en hepatocitos de trucha el aumento de volumen genera salida de ATP y activación de RVD, la incubación de estas células con removedores de nucleótidos debería inhibir el RVD significativamente. De hecho, 3 U/ml de apirasa o Na,K-ATPasa, inhibieron el RVD en 60% o 78%, reportando que nucleótidos endógenos participan en esta respuesta Microsomas de hepatocitos  fueron examinados por Western Blot. Se utilizaron anticuerpos contra E-NTPDasas de mamífero, detectándose proteínas de 55-65 kDa. Esto sugiere que existen  regiones conservadas entre las proteínas de ambas clases de vertebrados. Conclusión: Hepatocitos de trucha presentan al menos una E-NTPDasa con actividad ATPásica, acoplada a un sistema de desfosforilación total del ATP. E-NTPDasas estarían implicadas en la regulación volumétrica de células sometidas a medio hipotónico. Subsidios  F Antorchas, UBA, CONICET, ANPCyT (11017).