Caracterización de actividad E-NTPDasica de celulas de hepatoma humano.

PAGNI, RM., G. VENERA, AND P. J. SCHWARZBAUM

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXII Latinoamerican and first ibero-american congress of physiological sciences; 2006

Sociedad Argentina de Fisiologia

Caracterización de actividad E-NTPDásica de células de hepatoma humano R. M. Pagni, G. Venera, P. J. Schwarzbaum. IQUIFIB. Facultad de Farmacia y Bioquimica (UBA), Buenos Aires, Argentina. En todas las células animales estudiadas, existen nucleósidos di- y trifosfato presentes en el medio extracelular los cuales pueden ser sustratos de E-NTPDasas (ecto-nucleosido-trifosfato-difosfo hidrolasas), enzimas transmembrana con su sitio activo dispuesto hacia el lado extracelular. En el presente trabajo se caracterizó la actividad E-NTPDásica de HEPG2.Se determinó la velocidad de acumulación del Pi como producto de la reacción enzimática. Las concentraciones de nucleotidos utilizados fueron en el rango nM, para simular la situación in vivo, y concentraciones no limitantes (mM), para estimar la máxima capacidad hidrolítica. Se midió, en presencia de células enteras: i) actividad ecto-ATPásica (denominada vi); ii) actividad ecto-nucleotidasa máxima aparente (Vmaxapp) en presencia de 2 mM de ATP, UTP, UDP o ADP. Además, se determinó la actividad ectoATPásica a partir de una fracción microsomal cruda (Vmicr). Los resultados muestran que: vi aumentó de manera no lineal con 20; 100; 300 y 500 nM ATP, con vi de 1.4 10-04±3.1 10-05; 1.05 10‑3±5.66 10-4; 8.04 10-3±1.76 10-3; 3.08 10-2±1.7 10-2 nmolPi/106cel min, respectivamente. Con 10 mM EDTA vi fue inhibido 87%, y fue insensible a inhibidores de ATPasas de transporte iónico (NEM 1mM, oligomicina 2.6 mM, vanadato 10 mM) y de fosfatasas alcalinas (levamisol 1mM). Además, fue inhibido por AMP-CPP (análogo no hidrolizable del ATP) de manera exponencial (Ki=0.0170±0.0043 mM-1 e inhibición máxima del 60%). La Vmax app (nmol Pi/106cel.min) fue 71±3 (ATP); 7±4 (ADP); 25± 3 (UTP) y 6±1 (UDP). Por otro lado, Vmicr (nmol Pi/mg.min) fue de 155±9 mientras que con NEM 1mM, oligomicina 2.6 mM, vanadato 10 mM sin EDTA fue de 131±9, y con EDTA fue de 0.3. Es decir que el 86.9% de la actividad ectoATPasica total se puede asignar a E-NTPDasas. En conclusión, se caracterizó una actividad E-NTPDasa de HEPG2 con actividad hidrolitica para nucleosidos di y trifosfato de adenina y uracilo. Esta actividad es medible a concentraciones namomolares.