INVESTIGADORES
SCHWARZBAUM Pablo Julio
congresos y reuniones científicas
Título:
Regulación de ATP extracelular en eritrocitos humanos.
Autor/es:
LEAL DENIS F, INCICCO J, ESPELT MV, LAZAROWSKI ER, SCHWARZBAUM PJ
Lugar:
Rosario
Reunión:
Congreso; Reunion anual de la Sociedad Argentina de Fisiologia; 2012
Institución organizadora:
SAFIS
Resumen:
La mayoría de las células animales están expuestas al ATP y otros nucleótidos
presentes en el medio extracelular. Bajo la acción de estímulos fisiológicos
y farmacológicos los nucleótidos pueden acumularse e influenciar
en forma parácrina o autócrina varios procesos biológicos. Se estudiaron
los mecanismos que median la salida no lítica de ATP de eritrocitos humanos
a partir del análisis de la cinética de acumulación de ATP extracelular
(ATPe) frente a dos estímulos. Se utilizó mastoparán 7 (MST7), péptido
capaz de intercalarse en la membrana plasmática y activar proteínas G
triméricas, y 3V, cocktail de isoproterenol, forskolina y papaverina, cuyas
concentraciones fueron optimizadas para maximizar el aumento del AMPc
intracelular (inductor de la salida de ATP). Los ensayos se realizaron en ausencia
y en presencia de carbenoxolone (CBX), bloqueante de pannexina
1, la cual podría mediar el transporte de ATP. El ATPe fue cuantificado de
manera continua por la reacción de la luciferina luciferasa mediante dos
metodologías: 1- luciferasa soluble en el medio extracelular, sensando el
ATPe presente en el microambiente de las células; 2- luciferasa recombinante
(proA-luc) adherida a la superficie celular, sensando el ATPe del
nanoambiente celular. En presencia de luciferasa soluble, la exposición a
3V produjo un rápido incremento en la concentración de ATPe ([ATP]e)
a 0.98 ± 0.02 pmoles/106 células, 2 veces mayor al nivel basal. La preincubación
con CBX bloqueó completamente la respuesta, indicando que
la pannexina 1 actuaría como un poro permeable al ATP o como un mediador
esencial en la salida del nucleótido. Estos resultados fueron confirmados
al incubar eritrocitos de ratones wild type (WT) y knock-out en
pannexina 1 (KO) con 3V, en presencia o ausencia de CBX. En presencia de
proA-luc, la respuesta a 3V fue mayor, alcanzando la [ATP]e un pico a 2.4
± 1.13 pmoles/106 células, seguido de una disminución exponencial de la
[ATP]e hasta un valor similar al obtenido con luciferasa soluble. Mediante
modelado matemático se evaluól la dinámica de los cambios observados
entre el ATPe superficial y el ATPe presente en el microambiente. La exposición
a MST7 produjo un rápido incremento en la [ATP]e a 3.31 ± 0.21
pmoles/106 células, 6.9 veces mayor al nivel basal. La preincubación con
CBX bloqueó la respuesta en un 50%, indicando que el MST7 activaría al
menos dos mecanismos de salida de ATP, donde uno de ellos podría ser
mediado por pannexina 1. El mismo patrón se observó en eritrocitos de
ratones WT expuestos a MST7, mientras que la respuesta de eritrocitos
de WT frente al CBX fue similar a la del KO. Se concluye que las cinéticas
de ATPe observadas son compatibles con la salida de ATP mediante al
menos dos vías independientes. Para ambos estímulos, la concentración
del ATPe resultante permitiría, in vivo, la activación de receptores
purinérgicos que median respuestas celulares y sistémicas. Con subsidios
UBACYT (20020100100090), CONICET (PIP1187) y ANPCyT (0151)