Aislamiento, identificación y control de los agentes contaminantes en el cultivo in vitro de macroblastos de Pinus sp.

FERNÁNDEZ, C.; LUNA, C.; SANSBERRO, P.

Resistencia

Jornada; Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas; 2012

SGCyT (UNNE)

Con el propósito de desarrollar un procedimiento de clonación masiva a partir del cultivo de macroblastos de Pinus sp.; se procedió al aislamiento, identificación y control de agentes contaminantes endógenos que proliferan a partir de los subcultivos mediante la secuenciación del gen ribosomal ARNr 16S. Las secuencias de ADN obtenidas fueron comparadas con aquellas disponibles en el Banco de Genes NCBI (National Center of Biotechnology Information), determinándose un elevado grado de similitud con Bacillus megaterium y Bacillus subtilis. Una vez caracterizados e identificados los microorganismos causales de la contaminación, se realizaron varios experimentos tendientes a contrarrestar su proliferación, mediante el empleo de agentes químicos. Para ello, los explantes infectados fueron cultivados en biorreactores de inmersión temporal (10 explantes/recipiente) conteniendo 100 ml del medio basal, adicionado con PPM® o sus análogos (FC-1, FC-2, FC-3 y FC-4). Los biorreactores conteniendo el medio de cultivo (pH: 5.8) fueron esterilizados por autoclave (1.45 kg cm-2) durante 20 min. Los agentes biocidas fueron esterilizados por filtración (Millipore®, 0.22 micras). Los biocidas ensayados demostraron una alta eficiencia en la inhibición de la multiplicación celular de ambas bacterias. No obstante, su adición al medio de cultivo provocó una serie de efectos fitotóxicos sobre el explante afectando negativamente el crecimiento y desarrollo de los brotes. En este sentido, del 30±10 al 78±5,9% de los explantes manifestaron síntomas de estrés oxidativos que determinaron su muerte prematura. La severidad del flagelo estuvo condicionada por el compuesto y/o concentración utilizada; siendo máxima cuando se adicionó al medio de cultivo con las formulaciones comerciales FC-2 o FC-4. El uso de PPM si bien no resultó deletéreo para el vegetal, inhibió fuertemente su crecimiento. Finalmente, el empleo de la formulación FC-3, independientemente de las concentraciones ensayadas, no afectó el crecimiento y desarrollo de los macroblastos, los cuales alcanzaron entre 36±1,5 y 40±1,5 mm de longitud. Estos resultados demuestran que el uso de biocidas derivados de las isotiazolonas podría constituirse en una herramienta alternativa al uso de antibióticos en el control de la proliferación de Bacillus megaterium y Bacillus subtilis en procedimientos de clonación que impliquen el uso del principio de inmersión temporal.