Desarrollo de un esquema de tipificación por secuenciación de locus múltiples (MLST) en Babesia bovis

GUILLEMI ELIANA; RUYBAL PAULA; RODRÍGUEZ BROGGI MARIA GUADALUPE; DELFINO SANTIAGO; PRINCIPI DARIO; PETRIGH ROMINA; NUÑEZ PABLO; FARBER MARISA; WILKOWSKY SILVINA

Santa Fe, Argentina

Otro; XXIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2009

Sociedad Argentina de Protozoología

La babesiosis causada por el protozoario Babesia bovis es una enfermedad hemoparasitaria de los bovinos que causa importantes pérdidas económicas a la ganadería. El empleo de metodologías de tipificación molecular resulta esencial para comprender la epidemiología de este parásito. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un esquema de MLST para B. bovis. Se evaluaron inicialmente 22 genes housekeeping; seleccionados del genoma anotado de B. bovis (www.vetmed.wsu.edu/research_vmp/Babesia-bovis) y en base a su aplicación en esquemas MLST para otros microorganismos eucariotas. Luego de amplificar y secuenciar un fragmento promedio de 700 pb, de estos 22 genes se seleccionaron 7, elegidos por su mayor cantidad de sitios polimórficos, su distribución en los cuatro cromosomas del parásito, ausencia de presión selectiva y especificidad frente al ADN de bovino y de los hemoparásitos B. bigemina y Anaplasma marginale, los cuales coinfectan frecuentemente el ganado de las regiones enzoóticas para B.bovis. Los 7 genes seleccionados fueron: gsk (glycogen synthase kinase-3 alpha), dnaJ (DnaJ domain containing protein), gpad (G-patch domain containing protein), pkid (protein kinase domain containing protein), rcc (regulator of chromosome condensation domain containing protein), rip9 (ribosomal protein L9, N-terminal domain containing protein), y sbp4 (spherical body protein 4). Para el análisis de las secuencias se desarrolló una pipeline bioinformática propia (MLST–pipeline) y disponible en forma remota en http://190.103.0.207. Esta pipeline permite ingresar las secuencias en forma de cromatogramas, realiza el armado de contigs, alineamiento de secuencias y asigna los haplotipos correspondientes a cada gen. La combinación de haplotipos para cada gen define el tipo de secuencia o sequence type. Se analizaron un total de 4 cepas de referencia (R1A, M1A, S2P y M2P) y 3 casos clínicos de babesiosis aguda (35, 249 y 394) de la provincia de Salta. Con las secuencias de los 7 genes concatenados se realizó un análisis filogenético utilizando el programa MEGA versión 3.1 y se obtuvo un dendograma con el método Neighbor-joining. El empleo de la técnica de MLST para Babesia bovis a mayor escala permitirá obtener información acerca de las relaciones filogenéticas entre los distintos aislamientos de este parásito. Además, la herramienta bioinformática desarrollada  facilita el análisis a gran escala, reduciendo significativamente el tiempo requerido para el procesado de los datos y minimizando los posibles errores. Este proyecto fue financiado con fondos de la ANPCYT-PICT 1634 y de INTA.