Clonado y expresión de ClpD, una chaperona cloroplástica de Arabidopsis thaliana

ROSANO, GERMÁN L; CECCARELLI, EDUARDO A

Rosario, Argentina

Congreso; VII Congreso y XXVI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2006

Sociedad de Biología de Rosario

La importación de proteínas a cloroplastos y la biogénesis de las estructuras celulares son procesos de suma importancia para el crecimiento de una planta. La participación de chaperonas moleculares en estos eventos es reconocida pero poco comprendida. Las mismas asisten en el plegado, ensamblaje y translocación de proteínas. Recientemente, en cloroplastos de plantas superiores se han encontrado chaperones de la familia Hsp100, conformada por tres miembros: ClpC1, ClpC2 y ClpD. Esta última es la única que se expresa en condiciones de estrés lumínico y por frío y sería la chaperona principal que asistiría en el plegado y translocación de proteínas en estas condiciones adversas. El objetivo del siguiente trabajo es clonar el gen que codifica para la proteína ClpD de Arabidopsis thaliana y expresarla en un sistema bacteriano. Para el clonado de ClpD, se utilizó el plásmido pUni51 (proveniente del banco de ADNc de A. thaliana RIKEN) el cual contiene el gen clpd y se lo utilizó como molde de PCR. Los cebadores contenían secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción NheI y NotI. Se amplificó un producto de 2650 pb, correspondiente a la forma madura de la proteína. Este producto fue purificado, digerido con NheI y NotI y ligado a los sitios correspondientes del vector pET28a (esto permite obtener la proteína fusionada a una extensión amino-terminal de seis residuos de histidina). La construcción final se usó para transformar células de Escherichia coli BL21(DE3)pLys´. Se ensayó la expresión de la proteína recombinante en cultivos de la cepa transformada. Luego de la lisis celular, se obtuvieron las fracciones solubles e insolubles y se estudiaron por SDS-PAGE y Western blot. La inmunodetección se llevó a cabo con anticuerpos anti-histidina. Se observó que en condiciones usuales de expresión (37 ºC, 1 mM IPTG, 2 hs) la proteína se obtenía totalmente en cuerpos de inclusión. Por lo tanto, se realizaron estudios de optimización de la expresión con distintas concentraciones de IPTG, a distintas temperaturas y tiempos de inducción variables. En todas las condiciones se observó una banda inmunorreactiva de peso molecular esperado (98 kDa). Se notó que en condiciones de expresión suaves (0,25 mM IPTG, 25 ºC, 4 h post inducción) se obtiene un 40% de la proteína en forma soluble. La banda de 98 kDa se utilizó para la obtención de anticuerpos. Mediante el uso de columnas de cromatografía de afinidad de níquel-agarosa, la proteína soluble fue aislada y se realizó una caracterización del estado de plegamiento y actividad de la misma.