Desarrollo de un sistema de conjugación eficiente para la transformación genética de Streptomyces sp. MC1

APARICIO, JUAN DANIEL; PAPPALARDO, CRISTHIAN GABRIEL; PERNODET, JEAN-LUC; ROSALES SORO, MARÍA DEL MILAGRO; POLTI, MARTA ALEJANDRA

San Miguel de Tucumán

Jornada; Jornadas de Jóvenes Investigadores 2021; 2021

IntroducciónStreptomyces sp MC1 produce numerosos metabolitos secundarios bioactivos con aplicaciones industriales, médicas y veterinarias (antibióticos, antitumorales, biopesticidas/bioherbicidas, entre otros). También cuenta con actividad inhibitoria de patógenos en plantas (biocontrol) y actividad promotora del crecimiento vegetal (fijación de N2, producción de sideróforos, etc.) de gran interés en agricultura. Además, presenta cualidades para su aplicación en procesos de biorremediación. Sin embargo, para mejorar estas cualidades y explotar su potencial es necesario comprender los sistemas genéticos implicados mediante técnicas moleculares innovadoras.ObjetivosOptimizar el sistema de conjugación entre E. coli S17-1 y Streptomyces sp. MC1.Materiales y métodosLa transformación de células supercompetentes (RbCl) de E. coli S17-1 se realizó por shock térmico a 42 ºC. Se utilizó el plásmido pSC001, el cual cuenta con resistencia a apramicina (Apr) y contiene el gen mgfp para la expresión de la proteína fluorescente verde monomérica mGFP y el sistema de integración φC31 en actinobacterias. Para la conjugación intergenérica se mezclaron células de E. coli S17-1/pSC001 y esporos de Streptomyces sp. MC1. Se evaluaron tres concentraciones de la cepa donante (×0,1; ×1 y ×10) y tres de la cepa receptora (10-7; 10-8 y 10-9). Luego de centrifugar se sembraron los pellets en placas con medio caseína almidón agar (CAA) adicionadas de MgCl2 y se las incubó a 30 ºC. Después de 14 h se cubrieron con 3 mL de CAA (1/2) adicionado de ácido nalidíxico + Apr y se incubaron a 30 ºC durante 7 d. Finalmente se calculó la frecuencia de transferencia (Nº de exconjugantes/Nº de células receptoras). En seis exconjugantes se evaluó la incorporación del plásmido pSC001(mediante amplificación del gen mgfp), la expresión de la proteína mGFP (mediante microscopía de fluorescencia) y la integración cromosómica del plásmido [mediante amplificación de cuatro regiones diferentes: attb (sitio de unión en la bacteria), attp (sitio de unión en el plásmido), attL (extremo izquierdo de inserción) y attR (extremo derecho de inserción)].ResultadosLa frecuencia de conjugación intergenérica fue mayor (2,6*10-5) cuando se utilizaron las menores concentraciones celulares. En los seis exconjugantes se confirmó la incorporación del plásmido pSC001 al obtenerse amplicones del tamaño esperado (1200 pb) y la expresión de la proteína mGFP al visualizarse fluorescencia verde. El sitio attb solo se amplificó en la cepa original de Streptomyces sp. MC1, el sitio attp solo en el plásmido y los sitios attL y attR solo en los exconjugantes, corroborando la integración cromosómica del plásmido.ConclusiónSe logró una conjugación eficiente entre E. coli S17-1 y Streptomyces sp. MC1 en medio CAA, usando concentraciones celulares de ×0,1 y 10-7, respectivamente. La capacidad de transferir secuencias de ADN manipuladas genéticamente de E. coli S17-1 a Streptomyces sp. MC1 mejorará significativamente las posibilidades de manipulación genética de esta actinobacteria.