Perfil de genes cry y actividad proteasa en cepas nativas de Bacillus thuringiensis patogenas hacia Spodoptera frugiperda

ALVAREZ, ANALIA; PERA, LICIA M.; VIRLA, EDUARDO G.; BAIGORI, MARIO D.

Tafi del Valle, Tucuman, Argentina

Jornada; XXV Jornadas Cientificas de la Asociacion de Biologia de Tucuman; 2008

Asociacion de Biologia de Tucuman

Introducción. Bacillus thuringiensis (Bt) produce proteínas Cry de efecto entomopatógeno. Las mismas están codificadas por genes de secuencia variable y, debido a su especificidad, el genotipo cry de una cepa constituye un buen indicador de su espectro de acción insecticida. Por otra parte, estas proteínas son activadas a su forma tóxica mediante proteasas del insecto blanco, así como también del microorganismo. Dichas enzimas ejercen una importante función en el mecanismo de la patogenicidad. Objetivo. Determinación de genes cry y de actividad proteasa relacionada a la biomasa, en tres cepas de Bt nativas, patógenas hacia Spodoptera frugiperda (Sf). Materiales y Métodos. El ADN total de las cepas nativas, así como el de la cepa control Bt kurstaki HD1 (Btk 4D1), fue aislado con CTAB (1). Los genes cry1 y 2 fueron amplificados mediante cebadores generales que amplifican una región conservada (2). Los genes cry1Aa, Ab, Ac, Ad y cry2Aa, Ab y Ac fueron aislados con cebadores específicos que amplifican una región variable (3,4). La PCR se realizó en un volumen final de 25 µl (14,6 µl agua; 5 µl buffer Taq ;0,1 µl de cada cebador, 0,2 µl Taq polimerasa y 5 µl ADN templado). Se emplearon las temperaturas y tiempos de ciclado indicadas en la bibliografía. La actividad proteolítica específica fue determinada utilizando azocaseína como sustrato (5). Resultados y Discusión. Las cepas Bt RT y Bt LSM presentaron genes cry1 y 2 de acuerdo a su elevado efecto entomopatógeno hacia Sf. cry1 y 2 han sido ampliamente relacionados a los aislamientos activos hacia lepidopteros y lepidopteros/dipteros, respectivamente. Los perfiles cry-específicos, así como la actividad proteolítica de cada cepa, se observan en la tabla. Bt RT presentó genotipo cry-específico diferente al de Bt LSM y al de Btk 4D1. Estas dos últimas, amplificaron para los mismos cebadores. Bt LQ no presentó productos de amplificación en las condiciones ensayadas, sugiriendo un genotipo diferente. La actividad de las proteasas asociadas a la biomasa, no se correlacionó con la virulencia. Sin embargo, estos resultados podrían aportar información útil para la elaboración de formulados comerciales de Bt, ya que la estructura celular puede actuar como una matriz natural capaz de proteger a las enzimas de la acción negativa de agentes ambientales. Cabe destacar que la actividad naturalmente inmovilizada de este tipo de enzima, no se ha reportado en la bibliografía. Bibliografía. (1) Doyle & Doyle, 1987. Phytochemical Bulletin 19, 11-15. (2) Bravo, et al., 1998. Appl. Environm. Microbiol 64, 4965-4972. (3) Cerón et al., 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60, 353-356. (4) Ben-Dov et al.,1997. Appl. Environ. Microbiol.  63, 4883-4890. (5) Secades & Guijarro, 1999. Appl. Environ. Microbiol.  (65), 9:  3969-3975. Cepa Act. Específica (U/g) ± DS Perfil cry Bt RT 1987,76 ± 98,33 cry1Ab, Ac y cry2Ab Bt LSM 1808,94 ± 92,57 cry1Aa, Ab, Ac y cry2Aa, Ab Bt LQ 1139,69 ± 25,31 sin amplificación Btk 4D1 945,86 ± 14,34 cry1Aa, Ab, Ac y cry2Aa, Ab