Inmovilización de la lipasa metagenómica LipC12 combinada con bioimprinting para la obtención de biocatalizadores aplicados a la hidrólisis de triglicéridos

DANIEL ALBERTO SANCHEZ; ROBSON CARLOS ALNOCH; GABRIELA MARTA TONETTO; NADIA KRIEGER; MARIA LUJAN FERREIRA

Posadas

Congreso; SAPROBIO 2021 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos: transfiriendo biotecnología para el desarrollo; 2021

Universidad Nacional de Misiones

Se llevó a cabo la inmovilización de la lipasa LipC12 sobre diferentes soportes combinada con la técnica de bioimprinting en una sola etapa. Los soportes seleccionados fueron quitosano, Accurel MP-1000, pellets de polipropileno, polipropileno en polvo, Nanomer I.44P e Immobead 150. La lipasa inmovilizada se aplicó en la hidrólisis de tricaprilina para evaluar la actividad y selectividad de las preparaciones inmovilizadas con LipC12. Se estableció un protocolo estándar para la inmovilización de LipC12 combinada con bioimprinting, en una única etapa, para todos los soportes. Para ello, se preparó una solución acuosa del extracto crudo de la lipasa utilizando 8 mg de extracto liofilizado por cada mililitro de agua destilada pH 6,5, como agente de bioimprinting se adicionaron 30 µmol de ácido oleico por cada 100 mg de extracto liofilizado y luego se añadió el soporte en una proporción de 20 mg del sólido por cada mililitro de la solución. La inmovilización se realizó durante 6 h en viales cerrados con agitación magnética a 700 rpm. La preparación inmovilizada se recuperó por filtración, se lavó dos veces con agua destilada y se secó en estufa a 35 °C durante 12 h. Las preparaciones de LipC12 inmovilizada con tratamiento de bioimprinting, fueron evaluadas en la hidrólisis de tricaprilina. Para ello, 1 mmol de tricaprilina, 10 mmol de agua y 1 ml de n-heptano se colocaron en viales de 10 ml. La reacción se llevó a cabo por 90 min a 40 °C, 600 rpm y empleando 15% (p/p) de lipasa inmovilizada respecto a la masa del triglicérido. Se tomaron muestras de reacción a los 30, 60 y 90 min de reacción y se determinó su composición por cromatografía de gases.Se observaron altas actividades hidrolíticas en tiempos tan cortos como 30 min para LipC12 inmovilizada sobre soportes hidrófobos (polipropileno en polvo, Accurel y Nanomer). Para estas preparaciones se detectó una importante generación de ácidos grasos libres, sin acumulación de glicéridos parciales, para los diferentes tiempos de reacción analizados. Los biocatalizadores obtenidos usando quitosano generaron niveles significativos de diglicéridos incluso en tiempos tan cortos como 30 min. Se observó un comportamiento similar para LipC12 inmovilizada en Immobead.Las altas actividades hidrolíticas para tiempos de reacción cortos encontradas para preparaciones inmovilizadas basadas en soportes con características hidrofóbicas pueden asociarse con una alta eficiencia de inmovilización combinada con la activación de lipasa debido a inmovilización en una interfase y con el tratamiento de bioimprinting.Los biocatalizadores con la mayor actividad hidrolítica también generaron las mayores fracciones de acilglicéridos inespecíficos. La fracción de 1-monocaprilina es considerablemente más alta que la fracción de 2-monocaprilina para biocatalizadores basados en soportes hidrófobos. Un comportamiento similar fue observado para el caso de los diglicéridos, LipC12 inmovilizada sobre soportes hidrófobos generó niveles importantes de 1,3-dicaprilina, mientras que inmovilizada sobre Immobead y quitosano permitió la generación de 1,2-dicaprilina en proporciones cercanas al 90%.La actividad y selectividad de la lipasa está relacionada con su conformación y la misma puede estar influenciada por el soporte de la inmovilización y el agente de bioimprinting.