Dendrímeros-sirna: nanonaves silenciadoras

ANA PAULA PEREZ; EDER LILIA ROMERO; MARIA JOSE MORILLA

Ixtapa Zihuatanejo

Congreso; XLI Congreso Nacional de Ciencias Farmacéuticas; 2008

Asociación Farmaceutica Mexicana

Introducción. La dificultad de RNAs pequeños de interferencia (siRNA) para acceder eficientemente a células blanco limita su uso como terapia silenciadora de genes in vivo. En los últimos años se han elaborado diferentes estrategias para sortear barreras anatomo-fisiológicas y lograr el acceso in vivo de los siRNAs. Sin embargo, el empleo de complejos inestables estructuralmente y principalmente de tamaño no controlado han producido resultados poco alentadores. Los dendrímeros son nanopolímeros tridimensionales formados por un core central y una superficie ramificada. Los dendrímeros PAMAM son polímeros de poliamidoamina, con un core de etilendiamina. Estos son nanosistemas de entrega de drogas únicos, ya que su tamaño esta comprendido en el rango nanométrico, poseen mínima polidispersidad y número de grupos superficiales estrictamente definido. Debido a estas características proponemos el uso nanosistemas de entrega de siRNA basados en dendrímeros PAMAM de carga superficial positiva. Objetivos. Hallar condiciones de preparación de complejos PAMAM/siRNA de tamaño controlado para obtener nanosistemas eficientes en la entrega de siRNA. Materiales y métodos. Se prepararon complejos binarios a partir de la combinación de distintas generaciones de dendrímeros PAMAM (G4, G5, G6 y G7) y siRNA anti-proteína fluorescente verde (eGFP), en distintas relaciones de carga +/-, (PAMAM/siRNA) (1/1, 5/1, 10/1 y 20/1). Los complejos se prepararon en Buffer Tris pH 7,5 en presencia o ausencia de NaCl. La formación de los complejos se estudió por desplazamiento de Bromuro de Etidio (BrEt). Además, tanto la formación de los complejos como la estabilidad de éstos en presencia de RNAsa y suero humano fueron determinadas por retardo electroforético. Asimismo, se formaron complejos ternarios combinando diferentes polímeros (ácido colomínico, dextran o quitosan) con dendrímeros y siRNA. El potencial Zeta y tamaño de los complejos se determinó empleando un nanoZ sizer (Malvern). La citotoxicidad de los complejos en células T98G, (glioblastoma) que realizan endocitosis y células J774 (macrófagos) con capacidad de realizar fagocitosis, se estudió por los métodos de MTT y LDH en función de la concentración de siRNA (50 y 100 nM) y de la relación +/-. Finalmente, se comparó la eficiencia de silenciamiento de los complejos binarios preparados en ausencia y presencia de NaCl, y de los terciarios con la del reactivo comercial Lipofectamina 2000. Resultados y discusión. La formación de los complejos binarios se evidenció por desplazamiento de BrEt intercalado al siRNA a partir de la interacción con dendrímeros. Por retardo electroforético también se verificó la formación de complejos, así como el desensamblaje en presencia SDS (detergente iónico). Los complejos permanecieron estables ante la dilución en suero humano y protegieron al siRNA de la acción de RNAsas. El potencial Zeta fue positivo en todos los complejos. Con respecto al tamaño, se observó una importante dependencia de la fuerza iónica del medio, en ausencia de NaCl se obtuvieron complejos de menor diámetro que en presencia de la sal. Entre los complejos binarios y terciarios, en ausencia de NaCl, no se registró una diferencia significativa de tamaños. La citotoxicidad, en ambos tipos celulares, fue sólo considerable en la mayor relación de carga +/- (20/1), lo que implica la mayor concentración de dendrímeros para cada generación utilizada. Los complejos preparados en presencia de NaCl no fueron eficientes en el silenciamiento de eGFP, probablemente debido a su gran tamaño. Por el contrario, en ausencia de NaCl, a pesar de obtener complejos de tamaños similares, la eficiencia de silenciamiento de los complejos binarios fue mayor que en los terciarios y ésta fue semejante a la de lipofectamina, alrededor de 50%. Conclusiones. Al preparar los complejos binarios PAMAM/siRNA en ausencia de NaCl se obtienen complejos de tamaño en el rango nanométrico que poseen una eficiencia de silenciamiento de alrededor de 50%. Además, estos complejos no resultaron citotóxicos in vitro en bajas concentraciones de dendrímeros. Por esto se podría proponer a los dendrímeros PAMAM como posibles candidatos para el delivery de siRNA.