Preparación y caracterización de NanoARQC triplemente dirigido: SR-A1, TLR-3 y TLR-7

YASYNSKA, OLENA; ANA PAULA PEREZ; EDER LILIA ROMERO

Jornada; 4ta Jornada de Jóvenes Bionanocientificxs (JoBion); 2022

Uno de los principales mecanismos de activación del sistema inmune innato consiste en laactivación de receptores de reconocimiento de patrones (RRPs) dentro de estos receptores encontramosal grupo de los Toll-like receptors (TLRs) que son proteínas transmembrana localizadas en la superficieextracelular y compartimientos endosomales. Los TLRs reconocen distintas clases de motivos microbianosestructuralmente conservados como ácidos nucleicos bacterianos, virales y endógenos. Se sabe quedistintos agonistas de TLR evocan potentes reacciones de inmunidad adquirida celular, por lo que se losemplea como adyuvantes de vacunas o monoterapia. Dos moléculas utilizadas para este fin son elimiquimod (IMQ) y el PolyIC. El IMQ es un ligando de TLR 7. Su uso requiere de estrategias que impidansu escape del sitio de administración ya que puede causar reacciones tipo shock séptico letales ycontribuir a la disfunción de órganos remotos, no relacionados físicamente con el área a tratar. Mientrasque el PolyIC es un ligando de TLR 3. Es necesario evitar elevadas dosis parenterales de este RNA sintéticoya que causa fiebre y anemia.En nuestro trabajo, proponemos incorporar los adyuvantes IMQ y PolyIC en nanovesículasarqueolipídicas (NanoARQC). Los arqueolípidos que conforman estás vesículas son lípidos provenientesdel arqueobacteria Halorubrum tebenquichense que se sabe, son reconocidas por receptores ScavengerA1 (SR-A1) lo que conduce a su extensiva internalización por células blanco y luego a un delivery masivo aendosomas. Mediante esta estrategia, esperamos obtener sinergia en la activación simultánea de TLR3 y7, magnificando así su adyuvancia y a la vez confinándola sitio-específicamente.En primer lugar, se prepararon y caracterizaron estructuralmente complejos de IMQ y PolyIC.Espectros de fluorescencia demostraron que PolyIC actúa como quencher de IMQ. Asimismo, medianteensayos de desplazamiento de naranja de acridina y el cálculo de K binding mediante la ecuación deConnors, que fue igual a 11267 ± 6021 M-1, encontramos que hay interacción espontánea entre las basesnitrogenadas de PolyIC e IMQ, formándose entre ambos un complejo de intercalación. Luego, se logróponer a punto la preparación de NanoARQC que mantuvo intacta la estructura de PolyIC y presentó un Zaverage de 543 ± 191 nm. Tras 24 h de incubación de NanoARQC con macrófagos humanos THP-1hallamos que concentraciones de 100 µg/ml de fosfolípidos, 5 µg/ml de IMQ y 10 µg/ml de PolyICresultaron no ser citotóxicas e indujeron una liberación significativa de TNF-α e IL-8 respecto a controlesde complejo libres y nanovesiculas de lípido convencional con el complejo incorporado.En conclusión, logramos combinar PolyIC e IMQ en una única nanopartícula arqueolipidica losuficientemente pequeña como para ser endocitada y capaz de inducir una pronunciada liberación deTNF-α e IL-8 en macrófagos.