CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

INVESTIGADORES

OYHENART jorge Anibal

datos académicos

artículos

libros

congresos y reuniones científicas

Título:

DIVERSIDAD MOLECULAR DE BACILLUS ANTHRACIS EN LA PROVINCIA DE LA PAMPA

Autor/es:

OYHENART, JORGE; FORT, MARCELO

Lugar:

Mercedes, Corrientes

Reunión:

Jornada; XVIII REUNIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA; 2010

Institución organizadora:

ASOCIACIÓN ARGENTINA DE VETERINARIOS DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO

Resumen:

Introducción Bacillus anthracis es el agente causal del ántrax o carbunclo bacteridiano, una enfermedad endémica en nuestro país.La vacunación permite controlar la aparición de la enfermedad pero debido a la escasa cobertura vacunal, brotes aislados se describen cada año. Considerada como una de las bacterias más monomórficas conocida, los estudios epidemiológicos de B. anthracis se basan principalmente en el estudio de variaciones o polimorfismos en las secuencias de ADN. El número variable de repeticiones en tándem (VNTR) localizadas en el gen vrrA consiste en cinco variantes con dos a seis copias de una repetición de doce pares de bases (VNTR2, VNTR3, VNTR4, VNTR5 y VNTR6) (1)(2). El análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) permite distinguir entre los cinco tipos reconocidos. Existen pocos estudios de variación entre aislamientos en nuestro país. Cuatro aislamientos caracterizados por grupos extranjeros se reconocieron de tipo VNTR5 (3), VNTR2 o VNTR4 (2). Un trabajo publicado recientemente con catorce aislamientos provenientes de brotes en las provincias de Buenos Aires, Entre Ríos, Santa Fe y La Pampa a lo largo de cincuenta años, indicó contrariamente que todos los aislamientos corresponden a una única variante, VNTR4 (4). De manera semejante, cuatro aislamientos de un brote en la provincia de Buenos Aires se reconocieron del tipo VNTR4 (http://www.laboratorioazul.com.ar). Deseando contribuir al conocimiento de este agente en nuestro país, hemos caracterizado cepas aisladas en la provincia de La Pampa entre los años 2003 y 2005. Objetivo Caracterizar una colección de 15 cepas de B. anthracis obtenidas de casos aislados en la provincia de La Pampa en base al número de repeticiones del locus vrrA. Materiales y Métodos Las cepas de campo analizadas fueron aisladas de 14 bovinos y un ovino durante brotes ocurridos en la provincia de La Pampa entre los años 2003 y 2005. Los aislamientos se realizaron en medios de agar sangre, cultivados a 37ºC. Para la identificación y diferenciación de otros Bacillus se consideró la formación de cápsula, motilidad, producción de hemólisis y el test de sensibilidad a la penicilina. Las cepas se mantuvieron congeladas a -20ºC en medio de leche con glicerina. El ADN de cada cepa se obtuvo calentando colonias resuspendidas en agua bidestilada a 98 °C durante 15 minutos. Tras 5 min de centrifugación a 14.000xg se colectó el sobrenadante y conservó a 20°C hasta tipificación por PCR. El número de copias de la unidad repetitiva del gen vrrA se determinó por PCR utilizando los primers EWA1 (5 TATGGTTGGTATTGCTG) y EWA2 (5ATGGTTCCGCCTTATCG) (1). Condiciones: 25 ul conteniendo 1X TaqPol buffer, 15 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.1 uM de cada primer, 10pmpl ADN, 5U TaqPol (PBL, Quilmes); con desnaturalización inicial a 95ºC, 5 min; 40 ciclos desnaturalización a 92ºC, 30s; hibridación a 52 ºC, 60s; y extensión a 72ºC, 30s; con una extensión final a 72ºC durante 7 min. Como control positivo se empleó la cepa Sterne 34F2 (VNTR4). Los productos de amplificación se migraron en gel de agarosa 2% y poliacrilamida 6% en buffer TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) junto a un marcador de 100pb (PBL). Se tiñeron con SYBR Green 1/10000 (Sigma), se observaron y fotografiaron bajo luz UV. Los productos de PCR se extrajeron del gel de agarosa con un kit Wizard SV PCR clean-up (Promega) y empleando los mismos primers se secuenciaron en un secuenciador automático ABI3130 (Applied Biosystems). Resultados Quince aislamientos de campo provenientes de casos aislados de carbunclo se analizaron por PCR para establecer la variante correspondiente del gen vrrA. El tamaño de banda hallado en catorce aislamientos coincidió con el de la cepa Sterne34F2, y correspondió a un VNTR4. Una cepa se reveló portadora de una banda de menor tamaño, y en apariencia correspondiente a un VNTR2. La secuenciación directa del fragmento de PCR permitió corroborar su correspondencia con un VNTR2. Discusión El único estudio realizado con numerosas cepas de B. anthracis provenientes de nuestro país halló una única variante. Nuestro trabajo sostiene la predominancia de la misma variante, aunque, y en coincidencia con otros autores (3)(6), hallamos que ésta no es la única. El empleo de B. anthracis como agente de bioterrorismo ha impulsado en otros países la investigación de la diversidad, abierto la posibilidad de identificar el origen de una infección y de desarrollar nuevos medios de protección. Nuestros laboratorios no disponen, en general, de la tecnología o los medios para emplear las técnicas recientemente desarrolladas para la genotipificación de cepas aisladas (7). Es necesario sin embargo llegar a un conocimiento acabado de las cepas fuentes de infección por algún medio, quizás a través de acciones concertadas entre todos los interesados.

enviar mensaje