Detección de Tritrichomonas foetus mediante LAMP

GRACIA MARTÍNEZ, FLORENCIA; FUCHS, LUMILA; FORT, MARCELO; OYHENART, JORGE

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiologia; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

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La enfermedad es causa de vaginitis, placentitis, aborto prematuro, flujo uterino y piómetra en la hembra y cursa sin síntomas en el macho. El diagnóstico temprano y la eliminación de animales positivos es la única medida eficaz para el control de la tricomonosis. La prueba diagnóstica más empleada es el cultivo durante 5 a 7 días y la visualización microscópica. La sensibilidad de un muestreo prepucial no supera el 70%, y la especificidad es cuestionada por la aparición de protozoos indistinguibles de T. foetus. La reacción de la polimerasa (PCR) permite aumentar la sensibilidad y especificidad en este diagnóstico, pero los costos de equipamiento y reactivos hacen difícil su generalización. La amplificación isotérmica mediada por bucles (loop mediated isothermal amplification, LAMP) es una técnica desarrollada para la amplificación específica de secuencias de ADN conocidas. La misma es rápida, altamente específica y no requiere equipamiento costoso. Objetivo Diseñar y optimizar una prueba de LAMP para la detección específica de T. foetus. Materiales y Métodos ADN genómico de T. foetus, distintos protozoos (T. vaginalis, Tetratrichomonas spp, Pentatrichomonas spp, Toxoplasma gondii)  y bacterias (Brucella abortus, Campylobacter fetus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginos y Stapylococcus aureus) se obtuvo por tratamiento con proteinasa K. Los primers para LAMP se diseñaron con PrimerExplorer (Eiken Chemical Co). Cantidades variables de ADN se incubaron 40 minutos a 65°C en 25 ul de reacción con: 0.2-0.8 µM de primers FIP y BIP, 0.1-0.4 µM de primers LF y LB, 0.05-0.1 µM de primers F3 y B3, 125 µM de dNTPs, 0.8 M betaína, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100 y  4U de polimerasa Bst (N. Engl. Biolabs). El resultado se juzgó por observación directa o fluorescencia tras adición de SYBR Green I (Molecular Probes) y mediante electroforesis en gel de agarosa. La especificidad se confirmó por secuenciado directo. Resultados Hemos diseñado una prueba de LAMP, basada en la secuencia del gen sod1, para la detección específica de T. foetus. La amplificación se optimizó y permitió detectar rápidamente ADN de T. foetus. La reacción se mostró negativa ante una serie de parásitos y bacterias así como DNA bovino y humano. El tiempo mínimo de incubación para obtener una reacción positiva fue de 35 minutos. El límite de detección obtenido fue de 1 genoma/reacción. Conclusiones Hemos diseñado un test para la amplificación específica de ADN de T. foetus. La rapidez, sensibilidad y especificidad demostradas permitirían sortear muchos inconvenientes del cultivo tradicional. El método desarrollado no depende de equipamiento costoso y podría adaptarse sin mayor esfuerzo a  laboratorios de baja complejidad en áreas rurales.