Mutagénesis dirigida aplicada al estudio de la especificidad de sustratos nucleotídicos en FNR de arveja

MUSUMECI, M. A.; RIAL, D. V; CECCARELLI, E. A.

Rosario

Congreso; VII Congreso de la Sociedad de Biología de Rosario; 2005

Sociedad de Biología de Rosario

Las Ferredoxina-NADP+ oxidorreductasas (FNR) constituyen una familia de enzimas que contienen FAD unido no covalentemente y su principal función es catalizar la transferencia reversible de electrones entre NADP(H) y ferredoxina ó flavodoxina. Para ello resulta escencial adquirir una disposición óptima entre la porción isoaloxazina del FAD y nicotinamida del NADP+. Este evento requiere un desplazamiento de la cadena lateral de un residuo aromático presente en el extremo carboxilo terminal, ya que el mismo interacciona con la flavina, ocupando el sitio de unión de la porción nicotinamida. Cálculos teóricos aplicados a FNR de arveja indicaron que la orientación adoptada por el residuo aromático (Tyr308) se encuentra desestabilizada. Se propone como hipótesis que los residuos Cys266, Gly267 y Leu268 fueron seleccionados en virtud de su volumen para restringir la libertad de movimiento del residuo Tyr308 y desestabilizar su interacción con la flavina, produciendo una enzima eficiente. El objetivo del presente trabajo fue contribuir en la validación de la hipótesis. Para ello se procedió a disminuir en distintas proporciones el volumen relativo del espacio ocupado por los residuos Cys266, Gly267 y Leu268 mediante mutagénesis sitio dirigida. En el marco planteado, este efecto produciría mayor libertad de movimiento de Tyr308, logrando una conformación donde incremente su interacción con la isoaloxazina. Se utilizó la técnica del megaprimer, donde, en una primera etapa de PCR se introducen las mutaciones deseadas como resultado de un cambio intencional producido en el apareamiento entre un cebador diseñado en forma específica y el ADN molde. Luego, el producto de esta primera etapa (megaprimer) fue purificado y utilizado como cebador en una segunda PCR, así se lograron obtener distintas FNR mutantes. Un posterior análisis de secuenciación de ADN permitió verificar que las distintas mutantes fueron construídas de manera óptima. Una vez introducidas las mutaciones las enzimas fueron expresadas y purificadas. Para ello empleamos análisis de Western-Blot y cromatografías de afinidad y de exclusión molecular. Finalmente se determinaron los parámetros asociados a la reacción NADPH-K3Fe(CN)6 diaforasa (constante catalítica y constante de especificidad), los cuales evidenciaron una disminución en la eficiencia catalítica en la medida que se producía una mayor disminución en el volumen del sitio conformado por Cys266, Gly267 y Leu26A. De esta manera se puede concluir que las mutaciones producen enzimas menos eficientes desde un punto de vista fisiológico en una magnitud esperada. El avance en el conocimiento de esta enzima permite comprender el funcionamiento y la lógica estructural de otras flavoproteínas, ya que FNR es considerada como modelo de una gran familia de enzimas.