LA UBIQUITIN-LIGASA UBR1 Y LA DEUBIQUITINASA USP9X SON REQUERIDAS PARA LA AUTOFAGIA SELECTIVA DE GRANULOS DE ZIMOGENO MEDIADA POR VMP1 EN UN NUEVO MODELO CELULAR DE PANCREATITIS AGUDA

GRASSO, D; MOLEJÓN, MI; CAUSADA CALO, N; BOGGIO, V; ROPOLO, A; VACCARO, MI

Congreso; LV Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Reunión Científica Anual 2010 de la Sociedad Argentina de Fisiología y XLII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Farmacología Experimental. Mar del Plata, Argentina.; 2010

Zimofagia es la autofagia mediada por VMP1, capaz de degradar selectivamente los gránulos de zimógenos (GZ) alterados durante la pancreatitis aguda (PA) y de este modo prevenir los efectos severos de la enfermedad. Se ha descripto un rol del sistema de ubiquitinación en autofagia selectiva. La ausencia de la ubiquitin-ligasa UBR1 causa una PA de inicio gestacional. El objetivo fue evaluar el rol del sistema de ubiquitinación en la zimofagia. Usamos un modelo de PA por sobre-estimulación de los receptores a CCK en células acinares AR42J, diferenciadas con dexametasona. Comprobamos la zimofagia por inmunofluorescencia de VMP1, LC3 y amilasa. Demostramos que la zimofagia previene la activación de tripsina durante la PA, utilizando el sustrato BZiPAR. Durante la PA UBR1 se trasloca a autofagosomas LC3 positivos colocalizando con VMP1. El uso de shRNA-UBR1 bloqueó la zimofagia durante la PA, demostrado por transfección con RFP-LC3 y VMP1-RFP. La evaluación con BZiPAR en las células knockdown para UBR1 evidenció abolición del efecto protector de VMP1 sobre la activación de tripsina. Por RT-PCR la expresión de la deubiquitinasa USP9x aumenta ante la PA a la vez que la proteína, por Western blot, disminuye, sugiriendo una acelerada degradación de USP9x durante la PA. Por inmunofluorescencia, USP9x colocaliza con VMP1 en autofagosomas inducidos por PA. Ambas proteínas se acumulan ante el tratamiento adicional con el inhibidor de flujo autofagico Cloroquina. El uso de shRNA-USP9x inhibió la autofagia e impidió la movilización de VMP1 desde el RE promoviendo acumulación de agregados proteicos. Utilizando pulldown comprobamos la interacción entre VMP1 y USP9x durante la PA. Concluimos que el sistema de ubiquitinación es requerido durante la zimofagia y proponemos a UBR1 como responsable de señalar los GZ alterados para su degradación autofágica. Asimismo, USP9x es requerida para la iniciación de esta autofagia selectiva mediada por VMP1 durante la PA.