IDENTIFICACIÓN, CLONADO Y ANÁLISIS DE LA SECUENCIA PROMOTORA DE VMP1, GEN DE AUTOFAGIA CARACTERIZADO EN CÉLULA ACINAR DURANTE LA PANCREATITIS

LO RE, A; MOLEJON, MI; PARDO, R; ROPOLO, A; VACCARO, MI

Mar del Plata

Congreso; LIV Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Investigación Clínica, LVII Reunión Anual Sociedad Argentina de Inmunología; 2009

El gen vmp1 codifica una proteína transmembrana que se expresa tempranamente en la célula acinar durante la pancreatitis y gatilla la autofagia. Nuestros objetivos fueron analizar por bioinformática al gen vmp1, identificar, clonar y evaluar experimentalmente su región promotora y buscar secuencias consenso para factores de transcripción involucrados en autofagia. Utilizamos la base de datos Ensembl y el programa MatInspector. Los resultados indicaron que el gen vmp1, de 133kb, se ubica en la posición 55,139,811-55,273,235 del cromosoma 17 del genoma humano y origina un transcripto de 2509pb que codifica la proteína de 406 aa VMP1. El transcripto conocido tiene 12 exones con el codón inicio en posición 22 del exón 2. Usando una secuencia de 2000pb upstream del gen se obtuvieron 4 posibles regiones promotoras. Entre ellas una de 617pb en la posición 55,139,295-55,139,911 del cromosoma 17 con dos potenciales sitios de inicio para la transcripción de 12 exones. Con los programas MatInspector, TF-Search, P-match y Alibaba 2.1 se identificaron posibles sitios para factores de transcripción relacionados a la respuesta a estrés celular (NFKB, CHOP-C, p300, etc.) y en particular a la autofagia (E2F). Evaluamos la actividad promotora en ensayos con el gen reportero luciferasa en células de mamífero. gDNA de células HeLa se usó para amplificar un fragmento de 1977pb upstream del gen vmp1 que se clonó en el plásmido reportero pGL3 Basic. Se transfectaron células HeLa con el plásmido pGL3-1977 y se sometieron a ayuno o tratamiento con rapamicina, ambos estímulos inductores de autofagia. Medimos actividad de luciferasa normalizando los valores por actividad de B-gal en las mismas muestras. Los resultados mostraron aumento (p