"Premio" La Autofagia revela un nuevo mecanismo de defensa celular en la pancreatitis aguda

VACCARO MI; GRASSO D; ROPOLO A; LO RE A; MOLEJÓN MI; BOGGIO V

Buenos Aires

Conferencia; Premio Academia Nacional de Medicina "Carlos Bonorino Udaondo"; 2011

Honorable Academia Nacional de Medicina

<!-- /* Font Definitions */ @font-face {font-family:Arial; panose-1:2 11 6 4 2 2 2 2 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536859905 -1073711037 9 0 511 0;} @font-face {font-family:"Cambria Math"; panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;} @font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-520092929 1073786111 9 0 415 0;} @font-face {font-family:Cambria; panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1073743103 0 0 415 0;} @font-face {font-family:"Book Antiqua"; panose-1:2 4 6 2 5 3 5 3 3 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:auto; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:3 0 0 0 1 0;} @font-face {font-family:Batang; mso-font-alt:바탕; mso-font-charset:129; mso-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-1342176593 1775729915 48 0 524447 0;} /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat:yes; mso-style-parent:""; margin-top:0cm; margin-right:0cm; margin-bottom:10.0pt; margin-left:0cm; line-height:115%; mso-pagination:widow-orphan; font-size:11.0pt; font-family:Calibri; mso-fareast-font-family:Calibri; mso-bidi-font-family:"Times New Roman";} p.MsoHeader, li.MsoHeader, div.MsoHeader {mso-style-noshow:yes; mso-style-priority:99; mso-style-link:"Header Char"; margin-top:0cm; margin-right:0cm; margin-bottom:10.0pt; margin-left:0cm; line-height:115%; mso-pagination:widow-orphan; tab-stops:center 234.0pt right 468.0pt; font-size:11.0pt; font-family:Calibri; mso-fareast-font-family:Calibri; mso-bidi-font-family:"Times New Roman";} span.HeaderChar {mso-style-name:"Header Char"; mso-style-noshow:yes; mso-style-priority:99; mso-style-unhide:no; mso-style-locked:yes; mso-style-link:Header; mso-ansi-font-size:11.0pt; mso-bidi-font-size:11.0pt; font-family:Calibri; mso-ascii-font-family:Calibri; mso-fareast-font-family:Calibri; mso-hansi-font-family:Calibri;} .MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props:yes; font-size:10.0pt; mso-ansi-font-size:10.0pt; mso-bidi-font-size:10.0pt; font-family:Cambria; mso-ascii-font-family:Cambria; mso-fareast-font-family:Cambria; mso-hansi-font-family:Cambria;} @page WordSection1 {size:21.0cm 841.95pt; margin:72.0pt 72.0pt 72.0pt 72.0pt; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.WordSection1 {page:WordSection1;} --> La Autofagia como Respuesta Celular Protectiva en la Enfermedad Aguda del Páncreas   La pancreatitis aguda es una enfermedad definida como la autodigestion del pancreas. Durante la pancreatitis aguda la activación prematura del tripsinógeno conduce a la activación intracelular de las enzimas digestivas producidas por la célula acinar. Estas producen injuria celular y son capaces de digerir el parénquima tisular, provocando necrosis e inflamación, conduciendo finalmente a falla multiorgánica y la muerte. A pesar de esto, la mayoría de los ataques de pancreatitis aguda son autolimitados, lo que sugiere que existe una respuesta de la célula acinar pancreática capaz de limitar la progresión de la enfermedad. Morfológicamente, la autofagia ha sido descripta como un evento celular temprano durante el desarrollo de la pancreatitis aunque su papel es poco claro. La autofagia es un proceso celular capaz de degradar componentes citoplasmáticos incluyendo organelas completas. Funcionalmente, se inicia con una vesícula pequeña, la membrana de aislamiento, que secuestra a los componentes a degradar, invaginándose sobre sí misma para formar una organela de doble membrana llamada autofagosoma. Durante el flujo autofágico, el autofagosoma finalmente se fusiona con lisosomas donde se degrada el material secuestrado. En el mecanismo molecular de la autofagia participan numerosas proteínas necesarias para la formación del autofagosoma. Una de estas, es Beclina1 que en la autofagia migra hacia la membrana autofagosomal junto con un complejo proteico con actividad de PI3K, necesario para el reclutamiento de otras proteínas autofágicas. Inicialmente la autofagia fue descripta como mecanismo de reciclado inespecífico de componentes celulares en condiciones carentes de nutrientes, sin embargo trabajos recientes demuestran la existencia de una autofagia selectiva, que comparte componentes con la autofagia basal, pero que posee proteínas adicionales que le confieren selectividad por el sustrato. Se ha sugerido al sistema de ubiquitinación como factor clave en esta selectividad. Interesantemente, la proteína p62 puede unirse a la ubiquitina y a la proteína autofágica LC3, y la inhibición de la autofagia produce la acumulación de agregados de p62. Esto sugiriere a p62 como puente entre la autofagia selectiva y la ubiquitinación, ambos como parte de un mecanismo de etiquetado proteico necesario para la autofagia selectiva. VMP1 es una proteína transmembrana fuertemente expresada en páncreas durante la pancreatitis aguda experimental que ha sido caracterizada en nuestro laboratorio como una nueva proteína relacionada a la autofagia. Su expresión en células de mamífero forma numerosas vesículas, donde VMP1 es parte de su membrana. In vivo, la expresión de VMP1 se correlaciona con la formación de vacuolas durante la pancreatitis experimental. VMP1 es parte de la membrana de los autofagosomas y es necesaria para gatillar la autofagia en mamíferos. Los objetivos principales de esta investigación consisten en evaluar el rol de la autfagia como evento celular temprano en la pancreatitis aguda mediante el estudio del proceso autofagico desencadenado por la expresión de VMP1 y caracterizar el mecanismo molecular de la autofagia mediada por VMP1 en el desarrollo de la pancreatitis. En este trabajo demostramos la interacción directa entre VMP1 y Beclina1, a través del dominio C-terminal de VMP1 al que denominamos dominio Atg. El dominio Atg de VMP1 es necesario para el desarrollo de la autofagia, debido a que la expresión de VMP1 carente del dominio Atg, es incapaz de formar autofagosomas. Utilizamos el ratón transgénico ElaI-VMP1, donde el gen de VMP1 fusionado a la proteína fluorescente verde (VMP1-EGFP) es dirigido por el promotor de elastasa pancreática I, lo que asegura una expresión constitutiva y especifica en páncreas exocrino de VMP1. Los estudios sobre este ratón y modelos experimentales de pancreatitis aguda en tejido aislado y en líneas celulares, permitieron demostrar que VMP1 gatilla la autofagia in vivo y que media la autofagia inducida por la pancreatitis aguda. Asimismo comprobamos que la expresión de VMP1 en el ratón transgénico durante la pancreatitis aguda produce el secuestro autofágico selectivo de gránulos de zimógeno en autofagosomas de gran tamaño, proceso al que denominamos zimofagia. Mediante perlas magnéticas unidas a anticuerpos específicos, aislamos por primera vez autofagosomas y comprobamos que los autofagosomas mediados por VMP1 secuestran selectivamente a los gránulos de zimógeno durante la pancreatitis aguda.  El sustrato fluorescente para tripsina en acinos aislados demostró que sorprendentemente son sólo aquellos gránulos de zimógenos activados por la enfermedad los secuestrados por la zimofagia, previniendo la diseminación de las enzimas activas y por consiguiente la muerte celular. Este efecto protector de la zimofagia sobre las células acinares fue comprobado in vivo, obteniendo una reducción muy significativa de los efectos severos de la pancreatitis aguda en el ratón con expresión constitutiva de VMP1 comparado con el wild type. Demostramos la participación del sistema de ubiquitinación en el proceso de zimofagia. Comprobamos que los gránulos de zimógeno activados prematuramente, son ubiquitinados para ser luego degradados por zimofagia. Asimismo, comprobamos la participación de la ubiquitin-ligasa Ubr1 y la ubiquitin-proteasa USP9x en la selectividad de la zimofagia por los gránulos de zimógeno. USP9x interacciona con VMP1 durante la pancreatitis, siendo necesaria para el efecto protector sobre la célula acinar pancreática. Finalmente, comprobamos por primera vez la presencia de zimofagia mediada por VMP1 en la pancreatitis aguda humana, lo que le confiere alta relevancia clínica a nuestros hallazgos. En conclusión, este trabajo caracteriza a nivel molecular, celular, tisular y sistémico el papel de la autofagia en la pancreatitis aguda. Describe el mecanismo por el cual VMP1 gatilla autofagia. Revela un nuevo tipo de autofagia selectiva –la zimofagia- que reconoce selectivamente a aquellos gránulos de zimógeno activados por la enfermedad, impidiendo la activación en cadena de otros zimógenos, la diseminación de tripsina activa en el citoplasma y la muerte celular. Este estudio también demuestra que la zimofagia mediada por VMP1 tiene una función relevante en la homeostasis de los gránulos secretorios y en la respuesta a la muerte celular y representa el único tipo de autofagia inducible por la enfermedad descripto en células secretoras. Esta nueva vía autofágica podría estar también involucrada en otros procesos patológicos que afectan a células secretoras, como la célula beta en la diabetes mellitus, o las células de Paneth en la enfermedad de Crohn.