DETERMINACIÓN DE LA ACTIVACIÓN DEL RECEPTOR PURINÉRGICO P2X2 ANTE PULSOS ULTRACORTOS DE ATP

MOFFATT LUCIANO; HUME RICHARD

Hotel Portal del Lago,Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina

Congreso; XXXIV REUNION ANUAL SOCIEDAD ARGENTINA DE BIOFISICA; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

Determinación de la activación del receptor purinérgico P2X2 ante pulsos ultracortos de ATP Luciano Moffatt1,2 & Richard I. Hume1 1 MCDB, University of Michigan 3095 Nat Sci Bldg, Ann Arbor, MI 48109, USA 2 dirección actual: Laboratorio de Biointerfases, INQUIMAE, FCEN, UBA, Pab 2 Ciudad Universitaria, Buenos Aires, 1428, Argentina, lmoffatt@qi.fcen.uba.ar Los receptores ionotrópicos responden a la presentación del agonista mediante la apertura intermitente de un canal que permite el pasaje de iones a través de la membrana plasmática. El meca­nismo de activación de los receptores involucra la acción concertada de varias subunidades y es más simple estudiarlo en los recep­tores purinérgicos P2X ya que forman canales homoméricos (North 2002). Experimentalmente seguimos la si­guiente estrategia: aplicar pulsos del agonista lo suficientemente breves (0.2 ms) como para que la mayor parte de los canales se abran luego de la finalización del pulso. De este modo, se simplifica enormemente el análisis cinético de los resultados obtenidos al poder separar lo que ocurre al unirse el agonista de lo que ocurre luego. Con el objeto de obtener una resolución temporal por debajo del milisegundo, se estudió detalladamente la respuesta dinámica del intercambiador de solucio­nes y se utilizó una corrección para mejorar su rendimiento (Stilson 2001). Se desarrolló un método para medir el intercambio de soluciones con el “patch” intacto, el cual se encontró que estaba de acuerdo con un modelo simple convec­tivo-difusivo unidimensional. Se estudió la respuesta de “excised out patches” de células HEK 293 expre­sando el receptor recombinante P2X2 de rata  a pulsos de 0.2 ms de ATP 0.1-10mM. Más del 66% de la respuesta ocurrió luego de que ATP fue quitado de la solución, de modo que se obtuvo una excelente resolución de la cinética de unión y de apertura del canal. Los resultados obtenidos muestran que existe un retraso en la apertura del canal respecto de la exposición del receptor a las concentraciones máximas de ATP. Este retraso implica la presencia de un estado transitorio del receptor entre la union del agonista y la apertura del canal. Este estado “activado” (flip, Colquhoun & Sivilotti 2004) se caracte­riza por haber incrementado la afinidad por el agonista y haber disminuido la barrera energética que impide la apertura del canal en ausencia del agonista. Los resultados obtenidos son compati­bles con dos modelos alternativos: 1) Activación global: los dominios de los sitios de unión al agonista están acopla­dos de tal modo que todos se activan al mismo tiempo. Cada molécula de ATP unida estabiliza el estado activado, solo el canal activado puede abrirse. 2) Activación local: cada dominio se puede activar independientemente del otro. Sólo los dominios unidos al ago­nista pueden activarse. Cada dominio activado contribuye a estabilizar el canal abierto. Referencias Colquhoun, D., & L.G. Sivilotti. 2004. Trends Neurosci. 27:337-344. North, R.A. 2002. Physiol Rev. 82:1013-1067. Stilson, S. A. et al 2001. IEEE Trans Biomed Eng. 48:806-814.