Clonado del dominio mas inmunogénico de la glicoproteína E del virus de la pseudorrabia porcina (PRV) en un sistema presentador de antígenos y expresión en baculovirus.

SERENA M.S.; METZ G. E.; PANEI, C. J.; MÓRTOLA E. C.; ECHEVERRÍA M. G.

Valle Hermoso, Córdoba

Conferencia; XVII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2007

Sociedad Argentina de Virología

El virus herpes suino tipo I o de la Pseudorrabia (PRV) es el agente causal de la Enfermedad de Aujeszky (EA). El hospedador natural del PRV es el cerdo, especie en la cual la infección por este virus se manifiesta de diferentes maneras, según se trate de individuos adultos o jóvenes. Mientras que en los primeros causa abortos e infecciones latentes, para los segundos resulta letal. Dicha enfermedad está ampliamente difundida en el mundo y en los países más desarrollados está siendo erradicada. Se ha identificado a la glicoproteína E (gE) como candidato a principal componente de una vacuna a subunidades y como componente de los reactivos para diagnóstico diferencial. El dominio más inmunogénico de la gE fue identificado entre el aminoácido 52 y 84 que corresponde a los epitopes: A (aa64-73 y 75-84), B (aa52-67) y D (aa68-82). En este trabajo se logró clonar la porción del gen gE que contiene el dominio más inmunogénico, en el vector de transferencia AcYM1-NS1 que incluye el gen que codifica para la proteina no estructural (NS1) del virus de la Lengua Azul. Dicha proteína se auto ensambla formando túbulos altamente inmunogénicos, utilizados como presentadores de antígenos, que estimulan una potente respuesta inmune.En una primera etapa se creó el plásmido pGEM-gE de 4777pb que contiene el gen gE de 1780 bp de la cepa CL-15 por clonado en el sitio NdeI de dicho vector. Posteriormente se obtuvo mediante cortes con enzimas de restricción (SpeI y BstYI), el fragmento con el dominio más inmunogénico localizado entre el aminoácido 52 y 84 que corresponde a los epitopes A, B y D; y fue clonado dentro del vector de transferencia AcYM1-NS1 mediante corte con las enzimas de restricción SpeI y BamHI. Se verificó la correcta inserción por digestión con endonucleasas de restricción y PCR. Para la generación del baculovirus recombinante, se cotransfectaron células de insectos SF21 con la construcción AcYM1-NS1/EpitgE y el ADN del baculovirus (BaculoGold-BD Biosciences) por la técnica de liposoma catiónico (Cellfectin Invitrogen). El aislamiento del clon recombinante para los epitopes inmunogénicos de gE, se llevó a cabo por ensayo en placa en celulas High Five y SF21 a partir del sobrenadante de cotransfección. La expresión de la proteína NS1 con los epitopes anteriormente señalados se identificó por peso molecular en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE), a partir de los lisados y los sobrenadantes de células infectadas con el baculovirus recombinante. La presencia de las proteínas recombinantes en el lisado de celulas High Five y SF21 se confirmó mediante la técnica de Western Blot, donde la proteína NS1 más los epitopes inmunogénicos de gE fueron ubicados en el rango de peso molecular esperado y reaccionaron específicamente con anticuerpos policlonales porcinos, y anticuerpo monoclonal anti-gE. Posteriormente se realizó inmunofluorescencia indirecta en ambos tipos celulares infectados utilizando también anticuerpos policlonales de cerdo, monoclonales anti-gE y policlonal anti-NS1 y en todos los casos la fluorescencia resultó específica.