Estudio de la inducción del estrés de Retículo Endoplásmico ante infección con una cepa del virus de arteritis equina

COLINA S; NOGUEIRAS J; WILLIMAN M; ASPITIA C; BIANCHI DS; SERENA MS; ECHEVERRÍA MG; METZ GE

Valle Hermoso

Otro; XLII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA; 2022

Laboratorio de Virología, Centro de MicrobiologíaBásica y Aplicada, Facultad de Ciencias Veterinarias,Universidad Nacional de La Plata; (2) Consejo Nacionalde Investigaciones Científicas y Tecnológicas; (3)Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, elDesarrollo Tecnológico y la Innovación; (4) Instituto deEstudios Inmunológicos y Fisiopatológicos, Facultad deCiencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata.El retículo endoplásmico (RE) es una organela de granimportancia debido a su papel en diversas funcionescelulares como la biosíntesis de proteínas y lípidos demembranas o como reservorio de iones de importanciacelular. Cualquier desbalance en su homeostasis esiniciado por la liberación de la chaperona BIP unida a 3proteínas reticulares denominadas PERK, IRE1, ATF6,proceso que activa dichas proteínas, traduciéndose enun estrés celular e iniciando la respuesta a proteínasdesplegadas o UPR, intentando así recuperar lahomeostasis perdida. Si esto no es posible y seprolonga en el tiempo, se activan procesos de muertecelular inducida por apoptosis. En los procesos deinfección viral, se genera estrés del RE debido a la altatasa de transcripción y traducción de proteínas virales.En este sentido, diversos grupos han demostrado lainducción de estrés de RE frente a diversas infeccionesvirales. Por lo tanto, el siguiente trabajo tiene comoobjetivo analizar la interacción del virus de arteritisequina (EAV) con vías seleccionadas de la UPR. Paraello, se prepararon pocillos de placas de 12 conmonocapas al 80% de células VERO CCL81. La infecciónviral se realizó por triplicado con la cepa Bucyrus delEAV, a una multiplicidad de infección de 1, a la vez quese utilizaron células sin infectar e incubadas conTunicamicina como control negativo y positivo,respectivamente. Se recogieron las células de losdiferentes ensayos y se extrajo el ARN total mediantekit ROCHE. El ARN total extraído fue cuantificado porespectrofotometría y 1 µg de muestra fueretrotranscripto con enzima M-MLV. Se analizóinicialmente mediante qPCR, la activación de BIP comoprecursor de la generación del estrés de REevidenciándose su activación a las 16 hpi. Se utilizóGAPDH como control interno y el método de ΔΔCt paraobtener los valores de cambio en los niveles deexpresión. Una vez confirmada la inducción del estrésreticular, se continuó con el análisis de la vía IRE1 de laUPR, para lo cual, se analizó la fosforilación de IRE1 porWestern blot y los niveles de procesamiento deltranscripto XBP1: XBP1 spliced y unspliced mediantePCR punto final. La técnica de Western blot evidencióla aparición de una banda de aproximadamente 110kDa correspondiente a la proteína IRE1 fosforiladatanto a las 12 y 24 hpi, mientras que por la técnica dePCR se demostró un aumento del transcriptoprocesado XBP1 spliced a las 16hpi con respecto alXBP1 unspliced. Los estudios realizados en el presentetrabajo, evidenciaron que la infección viral con unacepa patogénica de EAV induce estrés de RE activandoen principio, la vía IRE1 de la UPR. Estos resultadosestán en concordancia con otros trabajos en los cualesvirus de la misma familia que el EAV, como el PRRSV,inducen estrés reticular luego de la infección.Actualmente, se sigue trabajando en el estudio de lasdemás vías de la UPR intervinientes en el proceso deestrés de RE