Causas biológicas y ambientales de la estructuración en Triatoma infestans y las implicancias para los programas de control vectorial

SILVIA CATALÁ, DAVID GORLA, PATRICIA JUÁREZ, MARIA INES PICOLLO, FRANCISCO PANZERA, FRANÇOIS NOIREAU, MIRKO ROJAS CORTES, JEAN PIERRE DUJARDIN, EDUARDO ZERBA, CLAUDIA VASSENA, RUBEN PÉREZ, GUSTAVO CALDERÓN, LUCIANA ABRAHAN ET AL.

Asunción, Paraguay

Taller; Taller del Cono Sur: Actualizacion de la Tripanosiomiasis Americana; 2007

Como principal vector de Trypanosoma cruzi,  Triatoma infestans representa un grave problema de salud pública para los países del cono sur sudamericano. Brasil, Uruguay y Chile ya han logrado interrumpir la transmisión del parásito por T. infestans. Sin embargo, la especie aún mantiene abundantes poblaciones en una extensa zona en el centro de Argentina, en Bolivia, en el occidente de Paraguay y en el sur de Perú. En Argentina y en Bolivia se han descubierto también poblaciones silvestres. Los programas de control vectorial se enfrentan con serios interrogantes como por ej: cual es el origen de las reinfestaciones intra y peridomésticas luego de los rociados? Son poblaciones residuales o existe un intercambio importante de individuos entre habitats? Cuál es el grado de intercambio entre localidades? Un nuevo problema ha surgido a partir de 1999, cuando se descubrió la existencia de poblaciones resistentes a insecticidas piretroides en el norte de Argentina y en el occidente de Bolivia, lo cual ha llevado al uso de carbamatos y organofosforados para el control del vector (Picollo et al.  2005). Panzera et al. (2004) y Bargues et al. (2006)  identificaron dos grupos alopátricos en poblaciones de T. infestans:Andinas y No-andinas, que muestran importantes diferencias cromosómicas y en el contenido de DNA. Se ha sugerido que estas modificaciones resultan de cambios adaptativos en los vectores. Análisis cuantitativos de fenotipos también soportan la hipótesis de existencia de poblaciones bien diferenciadas dentro del área actual de distribución de T. infestans (Noireau et al. 2000, Catalá y Dujardin, 2001, Catalá y Torres, 2001). La existencia de poblaciones genética y fenéticamente diferentes podría indicar distintas capacidades en cuanto a su comportamiento, dispersión y aún en la capacidad vectorial. El objetivo general de este proyecto fue estudiar qué grado de diversidad existe en las poblaciones de T. infestans del Gran Chaco y valles mesotérmicos de Bolivia, donde la persistencia del vector causa graves problemas y requiere grandes esfuerzos de los servicios de control. El estudio abarcó caracteres ambientales, genéticos, fenéticos y toxicológicos. También incluyó análisis moleculares para comprender el flujo génico entre poblaciones silvestres y domésticas de una localidad Boliviana y la búsqueda de focos silvestres en el chaco argentino y paraguayo.             METODOLOGÍA GENERAL El área de colecta de especímenes se extiende desde los 67º45’ S hasta los 59º48’O y desde los 18º36’ a los 28º13’S. La altitud del terreno varió entre 129 a 3095 metros sobre el nivel del mar. Un total de 23 sitios fueron visitados y los insectos se colectaron en el intra y/o el peridomicilio. Cada sitio fue georeferenciado por GPS. Mas de 1000 adultos y ninfas fueron colectados. Una muestra de 450 adultos de ambos sexos fueron numerados individualmente y disecados. Las alas se utilizaron para el análisis de hidrocarburos cuticulares y para morfometría geométrica. Las patas, fijadas en etanol, se procesaron para análisis de DNA mitocondrial. Las gónadas, fijadas en 3:1 etanol- ácido acético sirvieron para estudios cromosómicos; y las antenas, conservadas en etanol 70% se utilizaron para determinar el fenotipo antenal. Se reservó una muestra de insectos vivos  (huevos y/o ninfas y/o adultos) para analizar la susceptibilidad a insecticidas piretroides. RESULTADOS Características ambientales del área de estudio Las características ambientales de las localidades incluidas en el proyecto, fueron evaluadas a través de una serie temporal de imágenes mensuales (1981-2000) provenientes del sensor AVHRR (satélite NOAA), y datos de la Misión de RADAR Shuttle (NASA). Se usaron 5 variables ambientales derivadas de la serie temporal con una resolución espacial de 8 x 8 km: temperatura de la superficie del suelo y del aire (AT y LST), radiación infrarroja media (MIR), índice de vegetación (NDVI) y déficit de presión de Vapor (VPD). Mediante el análisis temporal de Fourier, se obtuvieron 14 estadísticos descriptivos para cada variable: media, mínimo máximo, amplitud, fase y varianza correspondiente a ciclos con uno, dos o tres picos por año y la varianza contenida en los tres ciclos. Estos estadísticos, junto con datos de elevación del RADAR, conformaron los 71 descriptores del ambiente para cada sitio de muestreo. Los siguientes análisis incluyeron 27 sitios, localizados por sus coordenadas geográficas sobre las imágenes. En primer lugar, un análisis de similitud ambiental (agrupamiento UPGMA, distancia Euclídea) definió dos grupos principales: 12 localidades del Gran Chaco (Argentina, Bolivia y Paraguay); y 15 localidades de los Valles Andinos y región Alto-Andina. En el segundo se identificaron dos sub-grupos: los Andes altos y valles intermedios se separaron de los valles altos y bajos. Las variables que mejor definían los grupos se identificaron mediante un análisis discriminante: La varianza de VDP y el mínimo de LST fueron las variables con mayor poder de discriminación (3,7 % de error) entre los dos grupos principales. Los tres subgrupos fueron discriminados sin error por la media del VDP y la elevación: El Gran Chaco presentó la menor elevación y humedad; el grupo Andes altos- Valles intermedios fue menos húmedo y de mayor altura que el subgrupo valles alto-bajos. Cuando se consideraron 5 sub-grupos,  la elevación y la fase anual de MIR fueron las variables de mayor peso. Los modelos lineales obtenidos por Análisis Discrimantes se usaron para identificar áreas con características similares a los grupos definidos por el análisis de agrupamiento (Rogers 2000, Gorla 2002): Los mapas obtenidos mostraron que, mientras más sub-grupos son considerados, mayor es la discriminación y fragmentación de la región andina. Es posible diferenciar claramente entre tres regiones: el Gran Chaco mas homogéneo, la región de los Andes altos y, en medio de ambos una región muy heterogénea de valles andinos. 2.      Análisis citogenético de las poblaciones de T.infestans La dispersión de T. infestans desde Bolivia, como centro de origen, hacia el resto de Sur América, involucró importantes cambios genéticos reflejados principalmente en una pérdida de más del 35% de su genoma, particularmente secuencias de ADN altamente repetido reveladas como heterocromatina C (Panzera et al, 2004). Este proceso fue develado por la identificación de dos grupos cromosómicos alopátricos, denominados "Andino" y "No-Andino", claramente diferenciados en la cantidad de cromosomas con heterocromatina y contenido total de ADN. A fin de resolver muchas de las interrogantes que persisten acerca de la dispersión de esta especie, este subproyecto involucró el estudio citogenético de poblaciones de T. infestans en la región denominada Gran Chaco y en los valles andinos mesotérmicos de Bolivia. El análisis, mediante bandeo C, de más de 150 individuos, permitió la  identificación por primera vez, de un tercer grupo o patrón cromosómico denominado “Intermedio”, localizado en un área bastante restringida y delimitada geográficamente ubicada entre el extremo norte de Argentina (Salvador Mazza, Prov. Salta) y el sur de Bolivia (Departamento Tarija). En estas localidades, concentradas en un radio inferior a 100 km, los individuos presentan patrones cromosómicos intermedios entre los grupos “Andino” y “no-Andino” (con 7 a 11 cromosomas heterocromáticos). Al menos existen dos posibles hipótesis para explicar la existencia de este citotipo “Intermedio”. La más obvia, es que formaría parte de un gradiente o clino geográfico Norte-Sur, donde las poblaciones se van diferenciando por el número de cromosomas heterocromáticos y por su tamaño genómico, reflejando la evolución y dispersión histórica de T. infestans. De tal forma que en el extremo norte estaría el grupo Andino (con mayor número de cromosomas heterocromáticos y con mayor cantidad de ADN), en el extremo sur el grupo no-Andino (menor número de cromosomas y tamaño genómico), y en medio de ambos grupos el citotipo Intermedio (con cantidades intermedias de ambos caracteres). Una segunda hipótesis es que este grupo intermedio se haya originado recientemente, siendo el resultado de la hibridación entre insectos Andinos y no-Andinos. Mediante un análisis detallado de patrones cromosómicos, haplotipos mitocondriales y nucleares, y eventualmente de marcadores fenéticos, sería posible discernir entre ambas hipótesis. La importancia de dilucidar el origen del grupo “Intermedio” se realza, pues estos insectos han desarrollado una alta resistencia a insecticidas piretroides que ha conducido a importantes fallas en el control vectorial (Picollo et al. 2005). Por tanto, determinar si este grupo se ha originado recientemente o no, es importante para conocer el origen y predecir la dispersión de la resistencia en T. infestans. Por último, también hemos detectado, por primera vez en la familia Triatominae, la existencia de fragmentos cromosómicos, de significado biológico aún desconocido, presentes en insectos tanto de poblaciones resistentes como susceptibles a piretroides. Hidrocarburos cuticulares de Triatominos.             El patrón de hidrocarburos cuticulares se utilizó para establecer la diversidad fenotípica en función de la distribución geográfica. Asimismo se inició el estudio del rol potencial de los hidrocarburos cuticulares en la interacción insecto-insecticida. Se analizaron alas de 328 insectos provenientes de Argentina, Bolivia y Paraguay. Los lípidos cuticulares se extrajeron con hexano, los hidrocarburos se fraccionaron por cromatografía en columna y se analizaron mediante cromatografía gaseosa capilar (CGC) con programación de temperatura. Se efectuaron análisis de componentes principales y de clusters para evaluar el criterio de agrupación. Mediante análisis discriminante se evaluó la significancia y magnitud de las diferencias entre las agrupaciones definidas. Las relaciones entre las poblaciones se visualizaron mediante gráficos de puntajes canónicos, y mediante dendrogramas basados en las distancias de Mahalanobis. Por otra parte, se comparó la composición de los lípidos epicuticulares de poblaciones susceptibles y resistentes (S. Mazza, Salta) mediante cromatografías gaseosa capilar y planar. En los hidrocarburos de T. infestans predomina una mezcla compleja de cadenas lineales de 27 a 33 átomos de carbono (KIs 2700 to 3300) junto con una variedad de cadenas ramificadas de más de 40 átomos (KIs 2970 a 4040). La variabilidad intraespecífica se analizó empleando los valores de abundancia relativa de cada componente. No se detectaron diferencias cualitativas, pero en base a las grandes variaciones cuantitativas se distinguen dos grandes grupos: en el más abundante y ampliamente distribuido en toda la región, abundan las cadenas lineales de KI 2700, 2900, 3100, y 3300. En el otro grupo predomina netamente n-nonacosano (KI 2900). Este grupo predomina en Catamarca, en menor grado en Santiago del Estero y en menor proporción en el resto de las regiones analizadas, disminuyendo marcadamente hacia el norte. Una pequeña parte de la población muestra una mayor abundancia relativa de cadenas múltiplemente ramificadas. Distribución geográfica: El análisis discriminante basado en las distancias de Mahalanobis muestra que los insectos de la región andina de Bolivia (Cochabamba, Potosí y Chuquisaca) se agrupan netamente separados del resto de las poblaciones analizadas. Dentro de cada grupo, los especímenes se agrupan en función de su cercanía geográfica, excepto Catamarca. En el estudio de los lípidos epicuticulares y su relación con el fenómeno de resistencia a insecticida, se detectó que las poblaciones resistentes tienen mayor contenido de hidrocarburos (≥ 1,5 veces) que los insectos susceptibles.             Característiscas fenotípicas de las poblaciones estudiadas Con el fin de evaluar cambios genotípicos asociados a la localización geográfica y el citotipo de las poblaciones bajo estudio, se analizaron los fenotipos antenales de 199 adultos, según la técnica propuesta por Catalá et al. (2005); y la simetría, conformación y tamaño de las alas según lo indicado en Schachter-Broide et al.(2004). Los datos se procesaron con los métodos uni y multivariados también descriptos en dichas publicaciones. Dos tipos de quimiosensilla antenales mostraron gran variabilidad entre poblaciones geográficas permitiendo construir un dendrograma (derivado de las distancias de Mahalanobis) que separa fenéticamente las poblaciones colectadas en el área andina de aquellas provenientes del Gran Chaco. Las poblaciones del Chaco seco (oeste) se separaron significativamente de aquellas obtenidas en la región más oriental chaqueña.  Todos los machos mostraron mayor abundancia que las hembras en un tipo de quimiosensilla.Cambios menores en el fenotipo antenal se observaron cuando se pudo comparar insectos de distintos habitats de una misma localidad. El análisis discriminante para fenotipos antenales, basado en los 3 citotipos, permitió separar significativamente los grupos, observándose una neta diferenciación entre el Andino y el No-andino, con el citotipo intermedio presentando características intermedias de ambos grupos. Un análisis de clusters con las dos variables más significativas en hembras, identificó claramente 3 fenotipos (AP 1, 2, 3). Las poblaciones correspondientes al citotipo Andino poseen AP 1 y 2, mientras en el citotipo No-Andino se encuentran el AP 2 y 3.  Para el citotipo intermedio se encontraron individuos AP 1, 2 y 3 , con predominio de AP 1 y 2. El AP 1, estrechamente asociado a las poblaciones andinas, se caracterizó por un número reducido de quimiosensilla con respecto al AP 3, asociado a poblaciones No-andinas, lo cual permite sugerir diferencias en la percepción sensorial y/o el comportamiento relacionado al habitat y hospedero. La conformación y la simetría alar no arrojaron resultados claros. Se estudiaron 8 poblaciones y no se observó relación entre simetría y  citotipo,  susceptibilidad a insecticidas o  altitud. Las poblaciones bajo estudio se separaron por su conformación pero no hubo relación con los citotipos. El tamaño alar varió mucho entre localidades con especímenes generalmente mayores en la zona andina (excepto una población) y menores en la región chaqueña. La población de Salvador Mazza no exhibió dimorfismo sexual de tamaño como en las demás poblaciones. 5. Variación genética y estructuración a nivel macro y micro-geográfico en poblaciones silvestres y domésticas de Triatoma infestans          Con el fin de desarrollar nuevas estrategias de control y vigilancia de T.infestans, es importante conocer la variabilidad genética del vector y la estructura de sus poblaciones. El estudio se refiere a una muestra de triatominos domésticos provenientes de cuatro poblaciones argentinas (Pablo Blanco, Catamarca; Salvador Maza y La Unión, Salta; Pampa Ávila, Chaco), y una población boliviana (Mataral, Cochabamba). Se analizó también una población silvestre de T. infestans proveniente de Cotapachi (Cochabamba, Bolivia).          Secuenciamos partes del gen mitocondrial del citocromo-b (CytB; 441 pares de bases) en 70 especimenes. Evidenciamos 33 sitios variables y caracterizamos 14 haplotipos, cuya distribución fue: 3 haplotipos definen las poblaciones de Argentina no-andina (Salvador Maza, La Unión y Pampa Ávila), y otros 3 la población Argentina andina (Pablo Blanco). Las poblaciones bolivianas se separan de todas las argentinas: Mataral está compuesta de 2 haplotipos y Cotapachi de 7 haplotipos.          Las 87 muestras secuenciadas en el citocromo oxidase I (COI) evidenciaron 23 sitios variables en 671 pares de bases, definiendo un total de 11 haplotipos. Las 4 poblaciones Argentinas están genéticamente próximas: las 3 no-andinas corresponden a 6 haplotipos, y la población andina a un solo haplotipo. Con respecto a las poblaciones Bolivianas, están compuestas de 4 haplotipos muy diferentes (3 corresponden a la población de Mataral y 2 a la población silvestre de Cotapachi).          Estos 2 marcadores mitocondriales han permitido demostrar una variabilidad genética y estructuración dentro de las poblaciones geográficas de T. infestans. Han permitido, principalmente, de distinguir poblaciones bolivianas andinas de poblaciones de Argentina. Además, el CytB ha permitido separar las poblaciones argentinas chaqueñas y de la región andina.             Hasta hoy en día, Bolivia es el único país donde focos silvestres de T. infestans están documentados (Noireau et al, 2005). La capacidad de dispersión de T. infestans silvestre ha sido estudiada a escala micro-geográfica en un sitio de los Andes bolivianos, para evaluar la posibilidad de recolonización activa por insectos silvestres en localidades rociadas. Nueve loci microsatélites fueron usados para detectar la existencia de flujo génico entre sitios de recolección próximos domésticos y silvestres (Richer et al, 2007). La ausencia de detección de flujo génico entre sitios silvestres cercanos pero distintos demuestra que, en elevada altura (2.750 m), T. infestans no se dispersa por vuelo. El vector se dispersaría gradualmente en cortas distancias si el terreno es uniforme. Finalmente, la diferenciación genética detectada entre poblaciones silvestres y domésticas sugiere un rol limitado a corto plazo de los insectos silvestres en el proceso de recolonización de las viviendas rociadas en la zona andina boliviana. Resistencia a insecticidas piretroides en poblaciones de Triatoma infestans provenientes de Paraguay, Bolivia y Argentina             Los programas de control de triatominos se realizan desde los 80 con insecticidas piretroides. Los primeros resultados de resistencia fueron obtenidos por el CIPEIN en la década del 90 con la aplicación del protocolo “ad hoc” de la OMS de 1994, que preconiza el uso de dosis discriminante (DD = DL99) para una primera evaluación de resistencia. Dentro del proyecto SSA el CIPEIN recibió 39 muestras de poblaciones de T. infestans de Argentina, Paraguay y Bolivia. Cuando el material biológico fue suficiente se realizaron las evaluaciones con DD de deltametrina para diagnosticar su posible resistencia a este piretroide (aplicación tópica en acetona de 2 ng/insecto del insecticida en ninfas I de 1,2 ± 0,2 mg de peso ayunadas desde la eclosión). Una supervivencia mayor que el 40 % sugiere un posible fenómeno de resistencia en marcha. Cuando esta mortalidad causada por DD es menor que el 20 % el fenómeno de resistencia podría estar dando lugar a posibles fallas de control. Cuando se dispuso de suficiente material biológico se obtuvieron los valores de dosis letal 50% (DL50) y grado de resistencia (GR), también en ninfas I. Los ensayos por DD indicaron resistencia con posibles fallas de control en poblaciones de T. infestans de Bolivia (Potosí, Chuquisaca, Cochabamba y Tarija) y de Salta, Argentina (Salvador Mazza y San Carlos) (algunos resultados previos fueron publicados por Picollo et al, 2005). Sobre muestras de T. infestans provenientes de Paraguay (Boquerón), Catamarca, Argentina (Palo Blanco), Chaco, Argentina (P. Avila y Tres de Febrero) y Salta, Argentina (La Unión) se estableció por DD que no había resistencia significativa a deltametrina que pudiera causar fallas de control (en las que se pudo determinar el GR fue < 5).  Sobre muestras de insectos de Salta, Argentina (Salvador Mazza y San Carlos) y de Bolivia (Sucre, Chuquisaca y Yacuiba, Tarija) se pudieron determinar altos valores de GR (entre 64 y 645) en consonancia con fallas de control. Los resultados obtenidos demostraron un perfil toxicológico similar entre poblaciones de Bolivia y el norte y oeste de Salta, Argentina, mientras que las del este de Salta fueron similares a las de Paraguay y las de Argentina recogidas en Chaco y Santiago del Estero. CONCLUSIONES Se demostró que dentro del gran área geográfica incluída en el estudio, existen zonas bien diferenciadas por variables ambientales. La temperatura mínima de la superficie del terreno y la varianza del déficit de presión de vapor (que estima la humedad relativa) permitieron caracterizar las regiones andina, chaqueña y una región intermedia correspondiente a la zona de contacto entre la región chaqueña y la andina, con un gradiente de cambios ambientales importantes en cortas distancias. Se observó asociación entre las variables ambientales y los 3 citotipos diferenciados por citogenética (se descubrió un nuevo citotipo nombrado “intermedio”que se agrega al Andino y  No andino anteriormente identificados). Se hallaron también modificaciones cromosómicas (fragmentación) no asociadas a citotipo u otra característica analizada. Las variables ambientales no necesariamente condicionan la ocurrencia de los citotipos, sin embargo, esta asociación permitiría identificar otras áreas de probable ocurrencia de fenotipos y citotipos específicos.  El análisis de los fenotipos antenales y los hidrocarburos cuticulares, encontró diferencias significativas entre los citotipos andino y no andino. Los fenotipos antenales evidenciaron dos grupos  significativamente separados asociados a estos dos citotipos. Un menor número de sensilla quimioreceptores en los andinos con respecto a los no andinos, sugiere posibles diferencias en la percepción de sustancias químicas ligadas a olfación y contacto. Se comprobó también un gradiente morfológico en los fenotipos antenales de las poblaciones de citotipo intermedio. Los fenotipos de hidrocarburos cuticulares identificaron separadamente los ejemplares de T.infestans provenientes del área andina boliviana. La resistencia a insecticidas piretroides se comprobó en  diferentes áreas sin que pueda asociarse netamente su ocurrencia con los tipos identificados por citogenética. Sin embargo, se observó una mayor tendencia a la aparicion de poblaciones resistentes en areas andinas y especialmente en las  intermedias. En el estudio de la microestructuración espacial de una población silvestre andina por microsatelites se pudo demostrar que cuando la cobertura del terreno es continua hay un flujo génico a largas distancias (en el orden de kilómetros) que podria relacionarse con la dinamica de distribucion de los reservorios silvestres. Por el contrario cuando hay una discontinuidad en la cobertura del terreno (ie. actividad antrópica, barreras naturales, comportamiento de territorialidad de poblaciones de roedores domesticos) no se observa el flujo génico entre poblaciones silvestres, identificándose unidades reproductivas separadas, incluso a cortas distancias (en el orden de centenas de metros). No se observó flujo génico entre las poblaciones domésticas y los diferentes sitios silvestres investigados. Los resultados del proyecto muestran que las poblaciones de T. infestans tienen una estructuración espacial que parece asociada con la existencia de grupos andino, no andino e intermedio. Los datos del proyecto no permiten concluir acerca del carácter discreto o continuo de la variabilidad de T. infestans. También se comprobó que esta especie posee una muy importante plasticidad fenotípica que sugiere  gran capacidad adaptativa. Los marcadores para diferenciar poblaciones de T. infestans, utilizados extensamente en este proyecto, están a disposición de los programas de control vectorial interesados en identificar las diferentes poblaciones del principal vector de la enfermedad de Chagas en el Cono Sur.