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ADSORCIÓN EN MATRICES INSOLUBLES DE ALGINATO COMO MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE QUIMOTRIPSINA Spelzini,Darío; López,Débora; Bercovich,Bárbara; Lombardi,Julia; Picó,Guillermo; Boeris,Valeria Laboratorio de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. CONICET. Suipacha 570. gpico@fbioyf.unr.edu.ar Introducción La quimotripsina (QT) es una enzima proteolítica que actúa en los sistemas digestivos de los mamíferos y otros organismos. Su PM es 25,7 kDa y su pI de 9,10. Se sintetiza como un precursor denominado quimotripsinógeno, catalíticamente inactivo. Esta enzima es utilizada en la industria agroalimentaria en general, en formulaciones de alimentos infantiles y en el tratamiento de cueros. Tradicionalmente, la purificación de la misma se realiza mediante un largo proceso que incluye varios pasos de precipitación (primero con sulfato de amonio y posteriormente con cloruro de calcio), cromatografía hidrofóbica y diafiltración, entre otras operaciones unitarias. Recientemente se han desarrollado nuevas metodologías de purificación de enzimas que involucran menos pasos, lo que redunda en un ahorro de tiempo y dinero. La adsorción en lecho fluidificado es muy utilizada en la purificación de proteínas a gran escala. Resulta una estrategia adecuada para el aislamiento de enzimas a partir de una materia prima compleja conteniendo partículas y restos celulares ya que las mismas pueden pasar libremente a través de la matriz sin bloquear el lecho, obstruir el flujo o producir aumentos en la presión. De esta manera, se consigue la separación simultánea sólido-líquido y el aislamiento selectivo de la enzima de interés. En este caso se plantea la utilización de matrices no comerciales a base de alginato de calcio. Estas matrices, a diferencia de las disponibles comercialmente, resultan muy económicas y son biodegradables, lo que resulta apropiado para el caso de un proceso en macro escala. El objetivo de este trabajo fue ensayar la capacidad adsorptiva de perlas de alginato insoluble aplicada a la recuperación y purificación de quimotripsina pancreática bovina (QT) a partir de su fuente natural. Metodología Preparación de las matrices de alginato: Las perlas de alginato (PA) fueron obtenidas goteando una solución de alginato 3%P/V sobre una solución de CaCl2 100 mM. Las perlas fueron lavadas y equilibradas en el medio apropiado antes de su uso como adsorbentes. Determinación de la actividad enzimática de QT: el ensayo se basa en la hidrólisis de bencil tirosin etil éster (BTEE) 0,6 mM en medio Tris-HCl 100 mM ? CaCl2 100 mM pH 8,2. La producción de bencil tirosina fue monitoreada mediante el incremento de la absorbancia a 256 nm durante 3 min cada 0,5s. Determinación de la concentración total de proteínas: fue llevada a cabo con el método de Lowry. Adsorción en lote de QT sobre PA: Se ensayó el efecto del pH, presencia de sales, temperatura y relación másica PA/adsorbato sobre la cinética, la capacidad adsorptiva y el proceso de purificación. Resultados Efecto del pH y la temperatura sobre la cinética de adsorción de QT sobre la matriz de PA Se realizaron ensayos de adsorción en lote de QT sobre las PA midiendo la concentración de enzima remanente en el sobrenadante a distintos tiempos. Esto permitió determinar las constantes cinéticas de adsorción, la energía de activación del proceso, la capacidad adsorptiva y el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio. Los datos se ajustaron a una ecuación de decaimiento exponencial: C=C0.e-kt, de acuerdo a una cinética de adsorción de primer orden. Se ensayaron 4 valores de pH (3,2 ? 3,8 ? 4,4 ? 5,0) y 4 valores de temperatura (30°C - 35°C - 40°C - 45°C). Se encontró que la capacidad de adsorción era mayor a pH 4,4 y que la cinética del proceso es altamente dependiente del pH y se incrementa con la temperatura. Efecto de la presencia de sales sobre la capacidad adsorptiva Se ensayó la presencia de distintas concentraciones de sales (NaF, NaCl y NaBr) sobre el proceso de adsorción para evaluar el efecto de la fuerza iónica y de la presencia de iones que alteran la estructura del agua ordenada. Como se muestra en la tabla I, se observa una clara disminución de la capacidad adsorptiva de la matriz al incrementarse la fuerza iónica. Esto indicaría que la interacción de QT con la matriz posee un componente electrostático. Por otro lado, a una concentración de 200 mM de sal, es mayor la capacidad adsorptiva de la matriz en presencia de NaBr, intermedia en presencia de NaCl y menor en presencia de NaF. La serie de Hofmeiter para los aniones monovalentes predice que a medida que aumenta el radio del ión aumenta la capacidad caotrópica sobre el agua ordenada. Esto estaría indicando que, en la interacción entre QT y la matriz estaría también involucrado el efecto hidrofóbico. Tabla I: Efecto de la presencia de sales sobre la capacidad adsorptiva de QT sobre PA Fuerza iónica (mM) Capacidad adsorptiva (UA/g) NaF NaCl NaBr 0 87 ± 3 87 ± 3 87 ± 3 50 97 ± 5 92 ± 4 91 ± 4 100 90 ± 3 87 ± 3 88 ± 3 200 28 ± 2 56 ± 2 83 ± 3 Evaluación del proceso de purificación de QT a partir de homogenado de páncreas bovino Se trabajó con 3 muestras de homogenado activado: 1) sin tratar, 2) centrifugado y 3) filtrado. Las operaciones de filtración y centrifugación se llevaron a cabo con el objeto de clarificar la muestra, eliminando restos celulares. Se evaluó la performance del proceso de purificación de QT luego de la adsorción en medio acetato/acético 25 mM pH 4.40 y desorción con medio Tris 25 mM ? CaCl2 5 mM pH 7.00 y no se encontraron diferencias significativas entre las distintas muestras (p>0.93). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla II. Tabla II: Proceso de purificación de QT a partir de homogenado de páncreas bovino por adsorción en lote sobre PA Muestra Masa PA (g) Vol. (mL) Actividad QT (UI/mL) Concentración de proteínas (mg/mL) Actividad específica (UI/mg) Rendimiento (%) Factor de purificación Homogenado - 100 41,6 ± 0,5 43,4 ± 0,4 0,96 ± 0,02 100 1 Eluído 10 20 130 ± 2 22,9 ± 0,2 5,7 ± 0,1 63 ± 2 5,9 ± 0,2 Eluído 5 20 71 ± 1 8,0 ± 0,1 8,9 ± 0,2 34,1 ± 0,9 9,3 ± 0,4 Conclusiones En este trabajo se aisló QT a partir de homogenado de páncreas mediante adsorción en PA sin necesidad de aplicar ningún tratamiento previo. El proceso presentado resultó una tecnología integradora ya que se combinó clarificación, concentración y purificación en una única operación unitaria evitando otros pasos como centrifugación o filtración de la materia prima. El adsorbente utilizado resulta económico, biodegradable y de fácil elaboración. La matriz no mostró tener afinidad específica por QT, sino que la interacción parece ser de naturaleza electrostática aunque también participaría el efecto hidrofóbico. Dependiendo de la proporción de adsorbente utilizado fue posible favorecer el rendimiento o la pureza del producto. Esto otorga flexibilidad al proceso, para ser aplicado según resulte conveniente.

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