Optimización del método de detección de compuestos fotoactivos antifúngicos de Porophyllum obscurum (Spreng.)DC.

POSTIGO, AGUSTINA; SUSANA A. ZACCHINO; MAXIMILANO SORTINO

Talca

Simposio; VII Simposio Internacional de Química de Productos Naturales y sus Aplicaciones; 2012

Introducción: Algunas plantas producen, como protección frente a patógenos y predadores, moléculas fotosensibles que, al ser excitadas por luz de una determinada longitud de onda, ejercen efectos tóxicos sobre biomoléculas y células, destruyéndolas. Éstas moléculas fotosensibles pueden ser utilizadas para inducir un daño en patógenos microbianos, surgiendo como una alternativa en el tratamiento de infecciones localizadas. El uso de compuestos fotoantifúngicos posee muchas ventajas frente a los tratamientos antifúngicos tradicionales, tales como amplio espectro de acción, baja probabilidad de generación de cepas fotorresistentes, mínimo daño a tejidos sanos del hospedero, compatibilidad con otras terapias antifúngicas y bajo costo (1). Objetivo: Optimización del método de detección de compuestos antifúngicos fotoactivos de Porophyllum obscurum (Spreng.) DC. utilizando el programa Design-Expert Materiales y Métodos: Preparación de extractos: P. obscurum fue recolectado en El Volcán, San Luis (Argentina) y depositada en el Herbario de la UNSL (Del Vitto & Petenatti #9014). Sus partes aéreas secas se extrajeron con metanol obteniéndose un extracto metanólico total (MeOHT). Éste fue fraccionado sucesivamente con Hexano (HEX), diclorometano (DCM), acetato de etilo (AcOEt) y Metanol (MeOH) obteniéndose cuatro sub-extractos. Ensayo de microdilución en caldo: Para determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de cada extracto o fracción se utilizó el método recomendado por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para levaduras (2) utilizando la cepa Candida albicans ATCC 10231. El porcentaje de inhibición fue leído como dispersión de la luz a 405 nm producido por el crecimiento fúngico con un lector de microplacas VERSA Max (Molecular Devices; Sunnyvale, CA, USA). Para evaluar el efecto fototóxico, la determinación fue realizada, paralelamente, en dos microplacas: una de ellas se mantuvo en la oscuridad y la otra se irradió, previamente a la incubación, con una fuente de luz de 350 nm Software: La influencia de los parámetros tiempo de irradiación (niveles 5 y 60 min) y distancia entre la microplaca y la fuente de luz (niveles 6 y 19 cm) fue determina y luego fueron obtenidos el tiempo y la distancia óptimos utilizando el software Design-Expert 6.0.10 (State-Ease Inc, MN, USA)(3). Se utilizaron los modelos Factorial Total para la fase de screening y Central Compuesto con 3 replicas del punto central para la fase de optimización. En esta última fase se obtuvo una superficie de respuesta graficando ambas variables en los eje x e y y en el eje z la respuesta obtenida, es decir el porcentaje de inhibición. Resultados y Conclusiones: MeOHT P. obscurum se evaluó frente a C. albicans, con el método de microdilución se irradió durante 1 h y la luz fue colocada a una distancia de 8 cm de la microplaca (valores de tiempo y distancia fijados arbitrariamente). El extracto presentó una CIM = 125 µg/mL luego de la irradiación, mientras que en oscuridad fue inactivo (CIM > 1000 µg/mL). Luego se realizó la optimización de las variables tiempo y distancia mediante la utilización de Design-Expert, que permitió realizarlo de una manera ágil y confiable. En la fase de screening se pudo comprobar que el efecto fototóxico se ve afectado por el tiempo de exposición y por la distancia entre la placa y la fuente de luz. Mediante la fase de optimización Design-Expert permitió determinan las condiciones de tiempo mínimo óptimo y distancia óptima que se requieren para obtener un mayor porcentaje de inhibición. El programa sugirió un tiempo óptimo de 54 min y una distancia óptima de 10 cm con un porcentaje de inhibición de 98%. Lo sugerido por Design-Expert se corroboró mediante un experimento independiente evaluando el extracto MeOHT luego de la irradiación al tiempo y la distancia óptimos. Que arrojó un porcentaje de inhibición de 96%. Una vez optimizadas dichas variables, se procedió al fraccionamiento del extracto MeOHT obteniéndose 4 sub-extractos, HEX, DCM, AcOEt y MeOH. Estos fueron evaluados por microdilución paralelamente en dos microplacas, irradiando una de ellas el tiempo y a la distancia óptimos antes de la incubación. Los resultados mostraron que en oscuridad los 4 sub-extractos son inactivos, mientras que los sub-extractos HEX y DCM fueron fotoactivos con CIMs de 3,9 y 7,8 µg/mL respectivamente. En trabajos futuros, se realizará el fraccionamiento bioguiado para el aislamiento de los compuestos fotosensibles. (1) Dai T., Huang Y-Y., Hambling M.R. (2009) Photodiagn Photodin Ther 6, 170-188 (2) CLSI (2008) Documento M27-A3, Wayne Ed., Pennsylvania. (3) Leonardi D., Lamas M.C., Olivieri A.C. (2008) J. Pharm Biomed Anal 48, 802-807. Agradecimientos: ANPCyT, PICT 0608 y 0049