Caracterización de la actividad de fosfatasas de serina/treonina en peces autóctonos como potenciales biomarcadores de exposición a microcistina LR

LEGUIZA, D.A.; GASULLA, J.; CARRIQUIRIBORDE, P.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXI Congreso Argentino de Toxicología ?Creando oportunidades frente a los nuevos desafíos desde la Toxicología?; 2019

Las microcistinas son heptapéptidos hepatotóxicos producidos por cianobacterias, principalmente del género Microcystis. Su presencia en cuerpos de agua constituye un problema de carácter ecológico, sanitario y económico, de cada vez mayor relevancia a causa del calentamiento global y la creciente eutrofización antropogénica. Las fosfatasas de serina/treonina son enzimas específicamente inhibidas por las microcistinas y por tanto suelen ser utilizadas como biomarcador de exposición. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar ?in vitro? la actividad fosfatasa en distintos tejidos de especies de peces nativos de la región pampeana mediante el uso de diferentes inhibidores y, en particular, mediante la incubación con Microcistina-LR. La actividad fosfatasa se midió a través de un método colorimétrico a 405 nm, usando p-nitrofenilfosfato (pNPP) como sustrato. Los inhibidores utilizados fueron molibdato de sodio, ortovanadato de sodio, tartrato de sodio e imidazol. Además, se ensayó una solución que incluyó todos los anteriores. Los tejidos evaluados fueron músculo de pacú (Piaractus mesopotamicus), tronco de larvas de pejerrey (Odontesthes bonariensis) y ejemplar completo o branquias de madrecita de agua (Cnesterodon decemmaculatus). Los tejidos fueron homogenizados en solución tampón TRIS-HCl pH 7,5 y la fracción citosólica obtenida (post mitocondrial) por centrifugación a 10000g durante 20 min. Sobre ellos se evalúo la acción de los inhibidores de fosfatasas no serina/treonina y la mezcla de ellos. Luego, los más efectivos se seleccionaron para a realizar las curvas de inhibición específicas por microcistina incubando la muestra con extractos de entre 0.3 a 300 ppb, purificados desde cultivo de la cianobacteria, en un medio de reacción conteniendo la mezcla de inhibidores. La actividad de fosfatasas totales varió entre especies, pero la respuesta a los inhibidores fue comparable en todas ellas, siendo el ortovanadato el inhibidor que mayor reducción de la actividad causó, resultando equivalente a la de la mezcla de todos los inhibidores. Las curvas de inhibición con las diferentes diluciones del extracto de la cianotoxina mostraron una inhibición máxima de 27% para madrecita y de 56% para pacú, no alcanzando el ?plateau? en las concentraciones máximas ensayadas. Los ensayos realizados sugieren que utilizar solamente ortovanadato sería suficiente para suprimir en gran medida la actividad de fosfatasas no específicamente inhibidas por microcistinas. Por otra parte, la inhibición producida por la cianotoxina en las especies ensayadas ?in vitro? alientan futuros experimentos de exposición ?in vivo? para emplear la actividad de dicha enzima como biomarcador de exposición a microcistinas en especies de peces nativos.