Desarrollo de una técnica de cuantificación de hormonas de expresión sexual en peces mediante HPLC-MS.

MARINO, D.; CARRIQUIRIBORDE, P.; RONCO, A.E.

Mardelplata, Argentina

Congreso; V Congreso Iberoamericano de Física y Química Ambiental.; 2008

Sociedad Iberoamericana de Física y Química Ambiental.

    En los peces las hormonas esteroideas difieren levemente respecto a los mamíferos. Los esteroides que intervienen en el desarrollo de los caracteres sexuales y de las gónadas son, en la hembra, el estradiol (E) y en los machos, la 11-ceto-testosterona (11-KT). La testosterona (T) actúa como un precursor de las anteriores y se encuentra en ambos sexos. Las concentraciones plasmáticas de estas hormonas varían durante las diferentes fases del ciclo reproductivo. Los niveles de testosterona en machos puede oscilar entre 0,4 y 100 ng/ml y en hembras entre 50 y 300 ng/ml. Los niveles de estradiol en hembras van desde los 0,1 a los 40 ng/ml y en machos de 0,2 a 0,8 Las concentraciones de 11-ceto-testosterona oscilan entre los 1 y los 100 ng/ml en machos y los 5 y 15 ng/ml en hembras. Es muy difundido en la comunidad científica el método de radioinmunoanálisis  (RIA)  para la determinación de este tipo de hormonas, son también conocidos los cuidados,  el número y complejidad de reactivos involucrados en el método y las limitaciones que presenta, pero todos estos inconvenientes quedan  en segundo plano a la hora de evaluar la sensibilidad del método. En el presente trabajo se desarrolla una técnica para la determinación de dichas hormonas usando métodos cromatográficos. En el mismo se utiliza un HPLC acoplado a un sistema de detección compuesto por un DAD y un espectrómetro de masas de cuadrupolo simple en serie. Se ensayan distintas condiciones separativas y se evalúa la influencia del pH de la fase móvil en la separación y en la ionización molecular. Se hace una comparación de las fuentes de ionización  de Electroespray  (ES) y de Ionización Química (APCI), los iones detectados en modo SCAN positivo fueron Hormona Fuente  Ion base  Ion Sec. 11-ceto-testosterona(11-KT) ES 303 [M+H]+ 627 [2M+Na]+ APCI 303 [M+H]+ No detectado Estradiol (E) ES 828 [3M-2OH+2Na]+ 273 [M+H]+ APCI 255 [M-OH]+ No detectado Testorona (T) ES 289 [M+H]+ 599 [2M+Na]+ APCI 289[M+H]+ No detectado La existencia de las aglomeraciones moleculares se justifica mediante cálculos teóricos en  función de las distintas estructuras moleculares. Por optimización de las condiciones instrumentales separativas y de detección en modo SIM  se detectaron 0,1 ng/ml de cada hormona en una misma corrida cromatográfica en forma inequívoca y sencilla, con un intervalo lineal 100, por uso de estándares externos de simple acceso y disponibilidad. De esta manera se obtiene el mismo nivel de cuantificación que el ofrecido por el método de RIA.