Homeostasis del ATP extracelular en eritrocitos de Xenopus laevis

MARÍA SOL BADORREY; MARÍA FLORENCIA LEAL DENIS; JUAN JEREMÍAS INCICCO; MARÍA VICTORIA ESPELT; PABLO JULIO SCHWARBAUM

Congreso; Reunión Anual SAFIS 2012; 2012

Los eritrocitos de Xenopus laevis constituyen un modelo celular para el estudio de procesos de transporte transmembrana de nucleótidos. En estas células se ha postulado ?pero no demostrado- que la concentración de ATP extracelular ([ATP]e) podría ser regulada por la interacción de: 1- La salida de ATP mediada por pannexina 1 o por exocitosis, lo que lleva a un aumento de la [ATP]e 2- La hidrólisis extracelular de ATPe por actividad ectoATPasa, lo que lleva a una disminución en la [ATP]e. El objetivo del presente trabajo es analizar los mecanismos que regulan la [ATP]e utilizando eritrocitos de Xenopus estimulados con mastoparán 7 (MST7), un péptido que se intercala en la membrana celular y activa proteínas G triméricas. La [ATP]e fue cuantificada de manera continua por la reacción de la luciferina luciferasa, mientras que la actividad ectoATPasa fue estimada a partir de la liberación de -32P-Pi de -32P-ATP. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos con poli-D-lisina (células adheridas) o sin poli-D-lisina (células no adheridas). Para identificar las vías de salida de ATP las células fueron preincubadas con brefeldina A (inhibidor de la exocitosis) o carbenoxolone (inhibidor de Pannexina 1). Resultados: - Tanto en presencia como en ausencia de adhesión celular, el MST7 produjo un aumento significativo de la [ATP]e con respecto al basal, pero en células adheridas este aumento fue 8.7 veces superior al obtenido con células no adheridas. - En células adheridas, la exposición a carbenoxolone redujo la salida de ATPe en 18.6%, mientras que la brefeldina A no indujo cambios significativos. - Se observó una importante actividad ectoATPasa de 1.2 ± 0.2 pmoles/106cells/min), que es 45 veces superior a la de eritrocitos humanos. Se construyó un modelo matemático que permite, mediante ajuste a los datos experimentales, cuantificar la importancia relativa de la salida de ATP y la hidrólisis de ATPe en la regulación de ATPe. Además el modelado permitió determinar el perfil cinético de los flujos de ATP que median la salida de ATP. Conclusiones: La adhesión celular constituye un importante preestimulo para la liberación de ATP mediada por MST7. La inhibición parcial de la [ATPe] con carbenoxolone indica que la pannexina 1 es capaz de mediar la liberación de ATP, mientras que la exocitosis no seria un mecanismo importante. Los cambios en la cinética del ATPe inducidos por MST7 son contrarrestados en parte por la actividad ectoATPasa.