INVESTIGADORES
LEAL DENIS Maria Florencia
congresos y reuniones científicas
Título:
Regulación de ATP extracelular en eritrocitos humanos
Autor/es:
MARÍA FLORENCIA LEAL DENIS; JUAN JEREMÍAS INCICCO; ESPELT MARÍA VICTORIA; LAZAROWSKI EDUARDO R.; SCHWARZBAUM PABLO JUIO
Reunión:
Congreso; Reunión Anual SAIC-SAFIS-ASCYTAL 2012; 2012
Resumen:
La mayoría de las células animales están expuestas al ATP y otros nucleótidos presentes en el medio extracelular. Bajo la acción de estímulos fisiológicos y farmacológicos los nucleótidos pueden acumularse e influenciar en forma parácrina o autócrina varios procesos biológicos. Se estudiaron los mecanismos que median la salida no lítica de ATP de eritrocitos humanos a partir del análisis de la cinética de acumulación de ATP extracelular (ATPe) frente a dos estímulos. Se utilizó mastoparán 7 (MST7), péptido capaz de intercalarse en la membrana plasmática y activar proteínas G triméricas, y 3V, cocktail de isoproterenol, forskolina y papaverina, cuyas concentraciones fueron optimizadas para maximizar el aumento del AMPc intracelular (inductor de la salida de ATP). Los ensayos se realizaron en ausencia y en presencia de carbenoxolone (CBX), bloqueante de pannexina 1, la cual podría mediar el transporte de ATP. El ATPe fue cuantificado de manera continua por la reacción de la luciferina-luciferasa mediante dos metodologías: 1- luciferasa soluble en el medio extracelular, sensando el ATPe presente en el microambiente de las células; 2- luciferasa recombinante (proA-luc) adherida a la superficie celular, sensando el ATPe del nanoambiente celular. En presencia de luciferasa soluble, la exposición a 3V produjo un rápido incremento en la concentración de ATPe ([ATP]e) a 0.98 ± 0.02 pmoles/106 células, 2 veces mayor al nivel basal. La preincubación con CBX bloqueó completamente la respuesta, indicando que la pannexina 1 actuaría como un poro permeable al ATP o como un mediador esencial en la salida del nucleótido. Estos resultados fueron confirmados al incubar eritrocitos de ratones wild type (WT) y knock-out en pannexina 1 (KO) con 3V, en presencia o ausencia de CBX. En presencia de proA-luc, la respuesta a 3V fue mayor, alcanzando la [ATP]e un pico a 2.4 ± 1.13 pmoles/106 células, seguido de una disminución exponencial de la [ATP]e hasta un valor similar al obtenido con luciferasa soluble. Mediante modelado matemático se evaluó la dinámica de los cambios observados entre el ATPe superficial y el ATPe presente en el microambiente. La exposición a MST7 produjo un rápido incremento en la [ATP]e a 3.31 ± 0.21 pmoles/106 células, 6.9 veces mayor al nivel basal. La preincubación con CBX bloqueó la respuesta en un 50%, indicando que el MST7 activaría al menos dos mecanismos de salida de ATP, donde uno de ellos podría ser mediado por pannexina 1. El mismo patrón se observó en eritrocitos de ratones WT expuestos a MST7, mientras que la respuesta de eritrocitos de WT frente al CBX fue similar a la del KO. Se concluye que las cinéticas de ATPe observadas son compatibles con la salida de ATP mediante al menos dos vías independientes. Para ambos estímulos, la concentración del ATPe resultante permitiría, in vivo, la activación de receptores purinérgicos que median respuestas celulares y sistémicas.