Una posible ß-lactamasa de inquilinus limosus

PINO MARYLÚ; GUTKIND GABRIEL; DI CONZA JOSÉ

Mar del Plata, Argentina

Congreso; Congreso Argentino de Infectología – SADI 2010; 2010

Sociedad Argentina de Infectología

Inquilinus limosus es un bacilo Gram negativo no fermentador de la clase a-Proteobacteria, familia Rhodospirillaceae. Esta especie es cada vez más aislada en pacientes con fibrosis quística (FQ), tal vez debido a la adquisición de un patrón de resistencia a múltiples antibióticos. Sin embargo, los mecanismos de resistencia asociados a los antibióticos son aún desconocidos.El aislamiento analizado proviene de un paciente con FQ del Hospital de Niños Dr. O. Alassia, de la ciudad de Santa Fe, en el año 2006. Aunque las pruebas de susceptibilidad de difusión por discos para este microorganismo aún no están estandarizadas por CLSI, no se ha observado zona de inhibición alrededor de los discos que contienen colistina, gentamicina, trimetoprima-sulfametoxazol y también a los antibióticos ß-lactámicos o su combinación con inhibidores de ß-lactamasas. Sin embargo, para los carbapenemes y amicacina se pudo observar halos de inhibición mayor a 30 mm.Nuestro objetivo fue describir la/s enzima/s ß-lactamasa/s presentes en I. limosus.Materiales y métodosFragmentos de ADN genómico fueron clonados al azar en el vector pK19; luego de transformar en E. coli TOP 10 F- se seleccionaron los clones resistentes a kanamicina y ampicilina simultáneamente.Se realizó prueba de sinergia empleando discos con ácido borónico. La actividad ß-lactamasa de los extractos crudos se evaluó con Nitrocefin y con el método iodométrico usando ampicilina como sustrato.Se ha intentado la amplificación de genes ampC mediante PCR múltiple, tanto en el ADN de I. limosus como en el clon seleccionado. La secuencia de ADN fue analizada con herramientas bioinformáticas “on-line”. ResultadosSe obtuvo un clon (INQK41) con un inserto de aproximadamente 9 kb. Este clon fue resistente a ampicilina y sensibles a cefepime. Además, se observó sinergia con el ácido borónico.Los extractos crudos de INQK41 y de I. limosus mostraron actividad ß-lactamasas. La actividad enzimática no pudo ser inhibida por ácido clavulánico o sulbactam. Sin embargo, no fue posible detectar sobre ambos microorganismos los genes ampC conocidos.Unos 7,5 kb del inserto presente en INQK41 fueron secuenciados hasta la fecha, mostrando un alto contenido en GC (promedio 70%). De estos, una región de 1083 pb presenta homología con varios genes que codifican ß-lactamasas depositados en bases de datos. El ORF teórico codifica una proteína de 361 aminoácidos con un codón de inicio inusual (GTG). Un péptido señal pudo ser predicho. Se observaron los motivos típicos de ß-lactamasas en la posición precisa (elemento SXXK, bucle YSD y el elemento HTG). El sitio activo de serina está presente en la posición común a las ß-lactamasas clase A y D. El “omega loop”, característico de las enzimas clase A, no pudo ser asignado con claridad. ConclusiónEl fragmento clonado del cromosoma de I. limosus presenta un supuesto ORF que podría codificar una enzima ß-lactamasa. La actividad detectada en los extractos crudos apoya esta hipótesis. Para determinar con mayor precisión la actividad de la proteína, se deberá llevar a cabo el clonado, la expresión y la purificación de la misma.