Caracterización cinética de una metalo-beta-lactamasa (LRA-12) proveniente del metagenoma ambiental de suelos de Alaska.

RODRIGUEZ MARGARITA; GHIGLIONE BÁRBARA; DI CONZA JOSÉ; MOE L; PEREZ GARÓFALO MAGALÍ; BLATEZKY ESTEBAN; WOLMAN F; HANDELSMAN J; GUTKIND GABRIEL; POWER PABLO

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Jornada; 157 Jornada Cientifica "Resistencia bacteriana y uso racional de los antibióticos"; 2013

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

La metagenómica incluye una serie de metodologías destinadas a la recuperación directa de genes o proteínas a partir de microorganismos no cultivables, comprendiendo generalmente la obtención de genotecas en Escherichia coli, y evitando el uso de técnicas de cultivo. De esta manera, varios genes de resistencia a antibióticos provenientes del metagenoma ambiental han sido descubiertos en muestras de suelo de Alaska, como genes codificantes de beta-lactamasas de las cuatro clases moleculares según Ambler. En este trabajo, nos hemos enfocado en el análisis fenotípico y bioquímico (propiedades cinéticas) de una metalo-beta-lactamasa (MBL) de clase B3, denominada LRA-12, previamente aislada de una muestra de suelo de Alaska. El gen blaLRA-12 fue clonado en vectores apropiados para evaluar el perfil de susceptibilidad a antimicrobianos en E. coli, de acuerdo a las recomendaciones de CLSI. LRA-12 fue además producida a partir de sistemas de sobre-expresión, y la MBL fue purificada hasta homogeneidad por cromatografía de afinidad por níquel e intercambio iónico. Los parámetros cinéticos en el estado estacionario (steady-state) fueron determinados para antibióticos beta-lactámicos, y las constantes de inhibición por ensayos competitivos para inhibidores. LRA-12 posee 61% de identidad aminoacídica con las MBL de la familia GOB provenientes de Elizabethkingia meningoseptica. Además, mostró un 41% y 33% de identidad con FEZ-1 (Fluoribacter gormanii) y BJP-1 (Bradyrhizobium japonicum), respectivamente, dos enzimas de clase B3 cuyas estructuras cristalográficas fueron previamente resueltas. Los clones productores de LRA-12 fueron resistentes a todos los beta-lactámicos ensayados, excepto aztreonam, y mostraron inhibición por EDTA. La enzima purificada mostró eficiencias catalíticas elevadas hacia la mayoría de los beta-lactámicos excepto monobactámicos (que se comportaron como inhibidores), de acuerdo al comportamiento esperado para una MBL. Los resultados respaldan la hipótesis acerca del origen de muchas beta-lactamasas que residen en los genomas bacterianos de especies ambientales. Estas beta-lactamasas pueden poseer una actividad nativa de amplio espectro compatible con las enzimas presentes en patógenos clínicos, y sus genes codificantes, de ser reclutadas por elementos de diseminación, podrían ser transferidas a bacterias asociadas al hombre y producir enzimas que directamente otorguen un perfil de resistencia elevada.