Análisis de la región promotora de blaCTX-M-2.

DI CONZA JOSÉ; AYALA JUAN; MOLLERACH MARTA; GUTKIND GABRIEL

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso Latinoamericano de Microbiología y X Congreso Argentino de Microbiología.; 2004

  CTX-M-2 es la b-lactamasa de espectro extendido (BLEE) prevalente en nuestro país. La mayoría de los promotores involucrados en la expresión de las BLEEs pertenecientes a la familia CTX-M fueron deducidos por homología a otros, pero pocos son los datos experimentales. En este trabajo se intentó analizar experimentalmente la  expresión de blaCTX-M-2 presente en un plásmido de multirresistencia aislado de Salmonella Infantis. Se secuenció la región de 500 bp “upstream” a blaCTX-M-2. Se comparó con las depositadas en base de datos observándose 100% de identidad con los RBS y las regiones -10 de los promotores teóricos propuestos para las cefotaximasas pertenecientes al subgrupo CTX-M-2 (CTX-M-4, -6, -7 y Toho-1). Además se observó una posible horquilla terminadora de la transcripción a +6 bp del codón de terminación. En un principio, se clonó el producto de PCR que incluye el gen blaCTX-M-2 y la región “upstream”, en vectores con distintos sistemas de selección. Independientemente de la orientación del inserto dentro del vector, se obtuvieron transformantes que presentaron resistencia a cefotaxima, la cual se revierte cuando se combina con ácido clavulánico. Además, en el extracto crudo de los transformantes se detectó iodométricamente una cefotaximasa de pI= 8,2. Por otro lado, se realizó un ensayo de transcripción y traducción in vitro empleando las construcciones antes mencionadas. En ellas se detectó la presencia de dos nuevos productos de expresión cuyo tamaño molecular coincide con la pre-proteína y la proteína madura de la enzima CTX-M-2. Estos resultados sugieren que dentro del segmento “upstream” a blaCTX-M-2 se encuentra la región promotora. Mediante RT-PCR, a partir de la cepa salvaje, pudo demostrarse la transcripción del segmento “upstream”, indicando que existiría al menos otro promotor corriente arriba a esta región. Estos resultados se correlacionan con la detección, mediante “Northern blot”, de blaCTX-M-2 mRNA monocistrónicos y otros de tamaño mucho mayor, los que fueron postulados como policistrónicos. Los ensayos de “primer extensión” realizados sobre el RNA obtenido de las cepas salvajes, permitieron detectar dos inicios de transcripción situados a -22 y -59 bp al codón de iniciación. Este resultado permite definir la existencia de dos posibles promotores, P1 y P2, y debido a la abundancia relativa de los transcriptos observados se especula que el promotor P1 sería más fuerte que el P2. Finalmente, la secuencia deducida para estos promotores, coinciden con la secuencia obtenida al realizar una predicción de promotores empleando el programa NNPP (Neural Netwok Promoter Prediction). Con los resultados obtenidos se infiere que la expresión de CTX-M-2 es compleja y dependiendo de el/los promotores que participen en el abanico de posibilidades que existen para la expresión de esta b-lactamasa, se tendrán distintos grados de resistencia a cefalosporinas de espectro extendido, inclusive dentro de una misma especie bacteriana.