Validación preliminar de un método para la detección de KPC desde hemocultivos positivos y otras muestras clínicas empleando MALDI-TOF MS

COSTA, AGUSTINA; DI CONZA JOSÉ; GUTKIND GABRIEL

Capital Fedral

Taller; VIII taller de la Red Nacional de Espectrometría de Masas aplicada a la Microbiología Clínica; 2022

RENAEM

La instauración rápida de una terapia antibiótica apropiada en pacientes con bacteriemia está asociada a un menor riesgo de mortalidad, por lo que es importante desarrollar metodologías que resuelvan con mayor rapidez el perfil de sensibilidad de los agentes etiológicos. En el laboratorio de microbiología clínica la detección de mecanismos de resistencia desde hemocultivos positivos, así como también para estudios de vigilancia, se realiza mediante métodos fenotípicos y automatizados que en general requieren del aislamiento del microorganismo en un medio sólido. Nuestro objetivo fue validar de forma preliminar la detección de KPC (y otras β-lactamasas) con MALDI-TOF MS a partir de modelos generados con botellas de hemocultivo, medios líquidos y muestras de orina inoculadas artificialmente, y a partir de pátinas obtenidas en medio sólido desde cada muestra. En segundo lugar, nos propusimos evaluar el desempeño de la metodología en un hospital de la zona.Como controles se analizaron cepas recombinantes y transformantes (y sus receptoras) para el gen blaKPC para determinar la posición en el espectro del pico correspondiente a la enzima. Para la validación de los modelos experimentales, se analizaron 93 muestras de hemocultivo (60 Klebsiella pneumoniae, 33 Escherichia coli), 94 muestras de caldo TSB (42 K. pneumoniae, 52 E. coli) y 78 muestras de urocultivo (42 K. pneumoniae, 36 E. coli) inoculados con aislamientos previamente caracterizados. A partir de estas muestras se obtuvo un pellet bacteriano y además se inoculó un medio sólido para la obtención de pátinas de crecimiento (4-5 h de incubación). Se realizó la extracción de proteínas desde el pellet (muestra directa) y desde la pátina con solventes orgánicos, y el extracto proteico fue utilizado empleando ácido sinapínico como matriz para su análisis con MALDI-TOF MS. Los espectros se adquirieron en el rango de 17-50 kDa en un equipo de Bruker LT versión 3.4 (Bruker Daltonics GmbH, Alemania). Se realizó el análisis visual de los espectros para la detección de los picos correspondientes a las enzimas y se crearon modelos estadísticos con los softwares flexAnalisis y ClinProTools (genetic algorithm), respectivamente. Además de la detección de proteínas en el rango de alto peso molecular, se realizó la identificación bacteriana a partir de todos los extractos utilizando como matriz HCCA.En la evaluación de los modelos experimentales se obtuvo una sensibilidad (S) y especificidad (E) para la detección directa de KPC a partir de hemocultivo del 91,7% y 100%, respectivamente, y del 86,5% (S) y 100% (E) desde la pátina. La detección directa y desde pátina desde medio líquido arrojó una S y una E del 100%. Para la detección directa desde urocultivo la S fue del 87,5% y la E del 100%, y desde pátina fueron del 100% para ambos parámetros. La identificación bacteriana fue concordante en todos los casos. Con respecto a la evaluación de la detección de KPC en el hospital, hasta el momento se analizaron 36 muestras de hemocultivo positivas con bacilos gram negativos, siguiendo el protocolo de extracción de proteínas validado anteriormente (directo y pátina). Además, se realizó la detección de KPC a partir de colonia de 31 cultivos obtenidos de hisopados de vigilancia (22) y otras muestras con sospecha de portación de carbapenemasas (9). La metodología empleada para la detección de enzimas desde colonia es la misma que la utilizada para pátinas de crecimiento. En primer lugar, se realizó el análisis visual de los espectros, y luego el desafío con los modelos creados con el software ClinProTools.La identificación bacteriana directa desde las botellas de hemocultivos arrojó una identificación no confiable en 5/36 muestras, y el resto de las identificaciones fueron concordantes con el método de rutina. La identificación desde pátinas obtenidas desde hemocultivos y desde colonia (procedentes de hisopados de vigilancia y otras muestras) fue concordante con el método de rutina en todos los casos.La detección de KPC desde hemocultivo a partir de muestra directa y pátina por MALDI-TOF MS mostró una concordancia con el método fenotípico (sinergia con discos) >90%. La concordancia para la detección de esta enzima desde colonia fue del 100%.La evaluación del desempeño de esta metodología en el área clínica se encuentra todavía en curso y se está analizando además la detección de la enzima KPC y otras β-lactamasas a partir de urocultivos y medios líquidos positivos inoculados con distintos materiales (líquido abdominal, líquido pleural, abscesos, etc.).Los resultados obtenidos en esta etapa del proyecto confirman que aquellos publicados en nuestra prueba de concepto (Figueroa-Espinosa R et al, 2019) pueden ser sostenidos con aislamientos y muestras de origen clínico. Esto permitiría, en paralelo con la identificación bacteriana, la detección temprana de la enzima KPC (aproximadamente media hora después del procesamiento de cultivos directos, o 4-5 horas después a partir de pátinas), permitiendo revisar con antelación el tratamiento antibiótico de los pacientes.