ESTUDIO PARALELO DEL CAMBIO CONFORMACIONAL Y LA OCLUSIÓN-DESOCLUSIÓN DE Rb+ EN LA Na+/K+-ATPasa.

MÓNICA R. MONTES, RODOLFO GONZÁLEZ-LEBRERO, PATRICO J. GARRAHAN Y ROLANDO C. ROSSI.

Villa Carlos Paz, Pcia. de Córdoba

Congreso; XXXIV Reunión Anual Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

La Na+/K+-ATPase acopla la hidrólisis de ATP al transporte de Na+ y K+ a través de la membrana plasmática. Durante su ciclo catalítico en que se verifican al menos los siguientes pasos 1- fosforilación de la enzima por ATP, 2- oclusión y desoclusión de los iones transportados y 3- transición entre los dos principales estados conformacionales E1 y E2. En un medio rico en Na o buffer simil-Na+ la ATPasa se encuentra en la conformación E1, en tanto en presencia de K prevalece la forma E2 En la enzima desfosforilada la liberación del K+ ocluido al lado citoplasmático se produce por el cambio conformacional desde E2 a E1, paso que resulta reversible ya que la adición de K+ provoca la oclusión del mismo y la transición E1®E2. El problema de cómo se relaciona la transición E1<-> E2 con el transporte de los iones no ha sido totalmente resuelto. Una aproximación al problema se puede realizar en principio, simplificando el sistema y analizando el comportamiento enzimático en un medio con Rb+ (congénere del K+) en ausencia de ATP de acuerdo al sig. esquema donde los paréntesis indican el Rb+ ocluído:             Esquema 1 En este sentido, analizamos en paralelo el cambio conformacional E1-> E2 y la oclusión de Rb+ y posteriormente el paso inverso, la desoclusión del Rb+ y la transición desde E2 hacia E1. Evaluamos si el cambio conformacional es simultaneo con la unión y liberación del catión o si un fenómeno es anterior a otro y es necesario plantear un paso adicional. Utilizamos la sonda fluorescente eosina‑Y para el seguimiento del cambio conformacional, ya que se une irreversiblemente a la enzima con alta afinidad por E1 y con baja afinidad a E2 (Skou and Esmann, BBA 1983). Mediante una técnica de filtrado (Rossi y col. Anal. Biochem. 1999) se determinó la oclusión o desoclusión de Rb+ midiendo la aparición o disminución de la enzima con el cation ocluido. RESULTADOS E1-> E2 vs oclusión de Rb+. Se adicionó Rb+, en concentraciones entre 20 y 500 µM, a la enzima marcada con eosina y se midió en el tiempo con un equipo de stopped flow la caída de la señal fluorescente (transición E1->E2) y con un equipo de mezclado rápido la formación del intermediario con Rb+ ocluido. Observamos que si bien ambos fenómenos ocurren con una cinética muy similar, el tiempo de vida media del cambio conformacional es menor al de la oclusión de Rb+ y que esta diferencia se debe principalmente a que el cambio conformacional finaliza cuando un 15-25% de la oclusión aún resta por ocurrir. E2-> E1 vs. desoclusión de Rb+. La enzima incubada con diferentes concentraciones de Rb+ (7 a 200 uM) fue mezclada en partes iguales con el buffer conteniendo eosina y 12 mM Na+. Las curvas normalizadas con respecto al cambio total de desoclusión de Rb y transción E2-E1 resultaron idénticas a lo largo del tiempo a concentraciones de Rb iguales o mayores a 50 uM. A concentraciones menores del cation se observa en el cambio fluorescente un componente rápido que no aparece en la desoclusión de Rb. La amplitud de esta fase estaría indicando la proporción de la enzima que se une rapidamente a eosina y por lo tanto sería una estimación de la cantidad de E1 en la enzima antes de reaccionar.Financian:UBA, ANPCyT y CONICET.