Mecanismo de acción del iridoide catalpol en la inhibición de Taq ADN polimerasa

PUNGITORE, C. R.; JURI AYUB, M.; BORKOWSKI, E. J.; TONN, C. E.; CIUFFO, G. M.

Mar del Plata. Buenos Aires.

Congreso; Congreso XV SINAQO; 2005

SINAQO

La correcta replicación del ADN por acción de las ADN polimerasas es esencial para la integridad del genoma y la correcta transmisión de la información genética en todos los seres vivos. Debido a esto, las ADN polimerasas han surgido recientemente como importantes blancos moleculares para el descubrimiento y desarrollo de agentes anti-cancerígenos. En orden de determinar el mecanismo de acción de catalpol se estudió su efecto inhibitorio frente a Taq ADN polimerasas bajo diferentes condiciones. Se observó que la actividad inhibitoria del compuesto es independiente del templado y set de “primer” usados. En efecto, catalpol inhibió tanto la amplificación del plásmido conteniendo el receptor de AT2 como la amplificación del gen de b-globina en ADN humano. Se estudio la posibilidad que catalpol actuara secuestrando iones Mg++, por adición de concentraciones crecientes de Mg++, durante el proceso de amplificación. Estas concentraciones crecientes de Mg++ no revirtieron la inhibición producida por catalpol, por lo que se dedujo que el compuesto actúa por un mecanismo diferente. Se comparó el perfil térmico de la doble hebra de ADN en presencia del iridoide para determinar si el compuesto se unía al ADN en comparación con bromuro de etidio. Mientras que bromuro de etidio afectó el perfil térmico de la doble hebra de ADN, el iridoide estudiado no produjo ningún efecto, sugiriendo que catalpol no se uniría al ADN. A partir de estos resultados se puede plantear la hipótesis que el inhibidor en estudio no estaría actuando como quelante de iones Mg++, ni tampoco como intercalante del ADN. En orden a investigar la interacción de catalpol con la enzima, se ejecutaron diferentes experiencias. Para determinar si el compuesto competía con el ADN templado por el sitio de unión al ADN, ensayos de PCRs con concentraciones crecientes de ADN fueron realizados. Se advirtió que concentraciones crecientes de ADN templado no pudieron reestablecer la actividad ADN polimerasa de la enzima, de este resultado se pudo asumir que catalpol no compite por el sitio de unión al ADN de Taq ADN polimerasa. Por otro lado, concentraciones crecientes de dNTP restauraron la actividad de Taq ADN polimerasa en presencia del compuesto, sugiriendo un mecanismo competitivo entre ellos. Estudios teóricos de cálculo de isosuperficies y posibilidades de uniones puente de hidrógeno entre catalpol y nucleósidos pirimidínicos apoyaron estos estudios experimentales. En orden de determinar el mecanismo de acción de catalpol se estudió su efecto inhibitorio frente a Taq ADN polimerasas bajo diferentes condiciones. Se observó que la actividad inhibitoria del compuesto es independiente del templado y set de “primer” usados. En efecto, catalpol inhibió tanto la amplificación del plásmido conteniendo el receptor de AT2 como la amplificación del gen de b-globina en ADN humano. Se estudio la posibilidad que catalpol actuara secuestrando iones Mg++, por adición de concentraciones crecientes de Mg++, durante el proceso de amplificación. Estas concentraciones crecientes de Mg++ no revirtieron la inhibición producida por catalpol, por lo que se dedujo que el compuesto actúa por un mecanismo diferente. Se comparó el perfil térmico de la doble hebra de ADN en presencia del iridoide para determinar si el compuesto se unía al ADN en comparación con bromuro de etidio. Mientras que bromuro de etidio afectó el perfil térmico de la doble hebra de ADN, el iridoide estudiado no produjo ningún efecto, sugiriendo que catalpol no se uniría al ADN. A partir de estos resultados se puede plantear la hipótesis que el inhibidor en estudio no estaría actuando como quelante de iones Mg++, ni tampoco como intercalante del ADN. En orden a investigar la interacción de catalpol con la enzima, se ejecutaron diferentes experiencias. Para determinar si el compuesto competía con el ADN templado por el sitio de unión al ADN, ensayos de PCRs con concentraciones crecientes de ADN fueron realizados. Se advirtió que concentraciones crecientes de ADN templado no pudieron reestablecer la actividad ADN polimerasa de la enzima, de este resultado se pudo asumir que catalpol no compite por el sitio de unión al ADN de Taq ADN polimerasa. Por otro lado, concentraciones crecientes de dNTP restauraron la actividad de Taq ADN polimerasa en presencia del compuesto, sugiriendo un mecanismo competitivo entre ellos. Estudios teóricos de cálculo de isosuperficies y posibilidades de uniones puente de hidrógeno entre catalpol y nucleósidos pirimidínicos apoyaron estos estudios experimentales.